缩宫素对人骨肉瘤细胞系MG-63增殖及成骨活性的影响

钱 明，刘 敏，段蒙娜，刘 畅，贺 玺，周延民

(吉林大学口腔医院口腔修复科，吉林 长春 130021)

老龄化以及女性绝经后发生的骨质疏松加重现象多与全身激素水平改变相关。女性卵巢功能衰退引起雌激素下降，就会导致骨生成和骨吸收的平衡被打破，骨吸收大于新骨形成骨量，造成骨质疏松。同样，男性骨代谢也受到雌激素的调节。缩宫素(oxytocin,OT)是自垂体后叶分离出的一种9肽激素，其在体内的主要作用包括在分娩过程中直接兴奋子宫平滑肌，促进其节律性收缩，具有催产、引产及减少产后出血等作用，故又被称为催产素，并且可刺激乳腺的平滑肌收缩，刺激泌乳。最近研究[1-3]发现：OT是对骨代谢有明确调节作用的多肽类药物之一。研究[3-6]表明：OT对骨形成的促进作用主要是通过局部的直接作用实现，在成骨细胞表面存在OT的功能性受体。目前国外仅有少量关于OT调节骨代谢方面的研究报道，且多以大鼠等动物为实验对象[7-8]。OT在骨代谢相关领域的研究国内未见报道。本研究旨在探讨OT在促进人骨肉瘤细胞系MG-63增殖及成骨活性方面的作用，为其全身及局部应用于调节骨代谢提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂人骨肉瘤细胞系(MG-63)购自上海细胞生物研究所；OT购自上海肽仕生物科技有限公司；四氮甲唑蓝(MTT)购自Sigma公司；碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)，ALP试剂盒购自南京建成生物工程研究所；胎牛血清、低糖DMEM及二甲基亚砜(DMSO)购自杭州四季青公司。

1.2 主要仪器CO2恒温培养箱(SANOY 美国)，超净工作台(上海医疗器械厂)，倒置显微镜(OLYMPUS 日本)，酶标仪(Bio-Rad，美国)，台式高速离心机(Hermlez323K，美国)，电子天平(上海生物仪器厂)，无菌手术器械、细胞培养管及细胞培养瓶。

1.3 细胞培养及鉴定MG-63细胞于含有10%胎牛血清的低糖DMEM培养基内，37℃、5% CO2全湿度培养箱培养。细胞贴壁培养7 d，达对数生长期，呈长梭型，长满培养瓶80%时，进行传代。倒掉旧培养基，PBS冲洗2次，加入0.25%胰蛋白酶液0.5 mL，消化25 s，加入新培养基终止消化，用吸管将残余贴壁细胞吹打下来并使之均匀，1∶2进行传代。同上方法传3代，至细胞生长稳定备用。

1.4 MTT法检测不同浓度OT作用后MG-63的增殖活性收集对数期MG-63细胞悬液，用细胞计数板调整细胞悬液浓度至2.5×104mL-1。取96孔板铺板，每孔200 μL,即每孔细胞数约为5 000个，37℃、5% CO2全湿度培养箱培养12 h至细胞贴壁，备用。将OT最终浓度设10、50和100 nmol·L-1共3个梯度，另设空白对照组，每组设3个复孔。加药后各板于37℃、5% CO2全湿度下培养1、3、5和7 d。每孔加MTT液20 μL，继续孵育4 h。去除培养液，每孔加150 μL的DMSO，摇床10 min，在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光度(A)值。

1.5 ELISA试剂盒检测不同浓度OT作用后MG-63的成骨活性参考MTT检测结果选取最低有效浓度50 nmol·L-1的OT作为实验浓度，分别检测OT作用1、3、5和7 d后MG-63细胞ALP活性的变化。具体方法为：收集对数期MG-63细胞悬液，调整细胞浓度在1×106mL-1，反复冻融破坏细胞，释放细胞内成分，2 500 r·min-1离心约15 min，收集上清。按照试剂盒操作标准进行加样、温浴、洗涤、加酶等操作，加入终止液并于10 min内在酶联免疫检测仪450 nm波长下依序测量各孔的A值。每次测定的同时按要求稀释标准品，测定出标准曲线。

2 结 果

2.1 MG-63细胞的形态学变化传代后4～6 h细胞贴壁，呈长梭形生长，细胞折光性良好，边界清晰，散在分布(图1A，见插页三)。5～7 d后细胞生长达对数期，分布呈鱼群状、漩涡状，细胞形态呈不规则多边形，伸出伪足，胞浆内可见不规则颗粒样物质，核仁清晰可见(图1B，见插页三)。

2.2 不同浓度OT作用下MG-63细胞增殖活性的变化MTT结果显示：10 nmol·L-1组OT作用7 d 后MG-63细胞增殖活性明显高于空白对照组(P<0.05)，50和100 nmol·L-1OT组在作用3、5和7 d 后MG-63细胞增殖活性明显高于空白对照组(P<0.05)。其他各组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3 最低有效浓度OT作用下MG-63细胞ALP活性的变化50 nmol·L-1OT作用下，MG-63细胞ALP活性随时间的延长显著增强，对照组随时间变化不明显；50 nmol·L-1OT作用3、5和7 d后MG-63细胞ALP活性显著高于空白对照组(P<0.05)。见表2。

表1 不同浓度OT作用不同时间后MG-63细胞增殖活性的变化

表2 50 nmol·L-1 OT作用不同时间后MG-63细胞ALP活性的变化

3 讨 论

OT是一种产科常用药物，药物流产后常规注射OT可止血及帮助子宫收缩。但随着OT在骨代谢领域相关作用的逐步阐明，更多的学者开始关注其在骨代谢领域的作用。目前国外学者主要关注OT在全身应用逆转骨质疏松方面的作用,局部应用修复骨缺损方面研究尚无相关文献报道。

本研究结果显示:10 nmol·L-1OT促进MG-63 细胞增殖作用不明显，而50 nmol·L-1以上浓度的OT能够通过直接作用于人成骨细胞MG-63，显著促进细胞增殖，根据MTT实验结果选择50 nmol·L-1作为OT作用于MG-63细胞的最低有效浓度进行的ELISA检测，实验结果表明：该浓度作用下MG-63细胞的ALP活性有显著提高。ALP是检测成骨细胞成骨活性的最重要和最直接的指标，本实验证明一定浓度下的OT可以直接作用于MG-63 细胞，增加其成骨活性。这也是将OT应用于局部治疗骨损伤、促进骨修复的前提。本实验仅证明了在一定浓度下OT对骨代谢有正向促进作用，但具体的浓度作用范围以及否存在剂量依赖性有待进一步研究。而且本实验以人骨肉瘤细胞系MG-63作为实验细胞，同实际在体内作用与成骨细胞还存在较大的差距，需要进一步实验验证。另外，OT的功能性受体存在于成骨细胞表面已经被国外学者[9-11]所证明，但是OT促进成骨细胞增殖分化的具体机制还有待进一步研究。

综上所述，尽管OT对骨代谢系统的调节机制尚未完全阐明，但是本实验通过不同浓度OT作用于MG-63细胞，对其增殖与成骨活性进行体外研究，验证了OT作为促进成骨药物局部应用于损伤部位的可行性，为临床局部应用OT修复骨损伤、促进成骨提供了参考依据。

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