河北省部分地区肉、蛋食品大肠杆菌污染状况的检测

史秋梅，张艳英，高桂生，高光平，程淑琴，裴玉欣

(1河北科技师范学院动物科技学院，河北省预防兽医学重点实验室，河北秦皇岛，066600，2河北旅游职业学院畜牧兽医系)

近年来，随着经济全球化进程的加快，食品安全已成为当今世界性公共卫生热点。食源性致病菌是引起食源性疾病的首要原因［1～4］，在人类的各种畜产品食用中，细菌性污染、中毒最为常见，而由大肠杆菌引起的食物中毒病例在食物中毒中居于前列。大肠杆菌对人类的感染主要取决于其血清型和食用者的身体状况。

许多血清型的大肠杆菌如出血性大肠杆菌，可导致宿主产生腹泻等食源性疾病及其他症状［5～7］。肠产志贺样毒素大肠杆菌(STEC)的致病性基因stx1与stx2分别编码1型与2型志贺氏毒素，能引起一系列人类疾病，包括水样腹泻、出血性肠炎、血小板减少性紫癜、溶血性尿毒综合征［8，9］。笔者通过对河北省的几个大型农贸市场和超市随机抽检的肉类食品采用国家标准法对抽样的肉类食品进行大肠杆菌的检测，同时对检出的大肠杆菌进行PCR复核性鉴定，并通过扩增stx1与stx2基因，检测STEC在食品中污染状况，以控制食品中大肠杆菌的污染，防止污染食品进入消费市场，为确保市场上食品的安全提供依据。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 样品来源 2010年7～9月从河北省的张家口、承德、廊坊、邯郸、石家庄、保定、秦皇岛市等市县超市或农贸市场无菌采集的肉、蛋类等，共计105份。

1．1．2 培养基及试剂 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤、EC肉汤、伊红美蓝琼脂(EMB)、营养琼脂斜面、色氨酸肉汤、MR－VP培养基、Korser氏枸椽酸盐肉汤、Butter－field氏磷酸盐缓冲稀释液、革兰染色液、Kovacs氏靛基质试剂、甲基红指示剂、Voges－proskauer(V－P)试剂按文献［10］制备。大肠杆菌STEC阳性对照菌株EK274(stx1，stx2阳性)购自中国兽药监察所，由本实验室保存。琼脂粉(天津市英博生化试剂有限公司)，树脂型TM基因组DNA提取试剂盒(购自北京赛百盛有限公司);Maker(2000 plus)(购自东盛生物有限公司)，PCR扩增引物由上海生物工程有限公司合成。

1．1．3 主要设备 K－3401半自动微生物鉴定仪(济南大欣医疗器械科技有限公司)、PCR扩增仪(东胜创新生物科技有限公司)、恒温培养振荡器(ZHWY－103B，上海智城分析仪器制造有限公司)、凝胶成像分析系统(BIO－BEST200E，美国西盟)、电泳仪等。

1．2 方法

1．2．1 样品制备 按照GB/T4789．4－2010方法以无菌操作称取样品25 g，放入装有225 mL稀释剂的灭菌均质杯内，于8 000 r/min均质1～2 min，制成1∶10样品匀浆液。

1．2．2 分离和筛选

①每个样品稀释液分别接种到月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤，每管接种1 mL。种管置于36℃培养48 h，观察试管的产气情况，检查倒管内是否有气泡产生，如所有LST肉汤管均未产气，则可报告为大肠杆菌阴性(未检出);如有产气者，记录LST产气情况，则进一步做证实试验。

②用接种环将所有48 h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。将所有接种的EC肉汤管在30 min内放入带盖44．5℃水浴箱内，培养48 h，记录EC肉汤管的产气情况。取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板36℃培养24 h。检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。如有典型菌落，则从每个平板上至少挑取2个典型菌落;如无典型菌落，则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面上36℃培养18～24 h。

1．2．3 生化鉴定 将斜面培养物接种到下列培养基中或试剂中进行生化试验。

色氨酸肉汤试验:在36℃培养24 h后，加Kovacs氏试剂0．2～0．3 mL，上层出现红色为靛基质阳性反应。MR－VP试验:在36℃培养48 h，以无菌操作移取培养物1～13 mL于100 mL管中，加50 g/L萘酚－乙醇溶液0．6 mL，质量浓度为400 g/L KOH溶液0．2 mL和少许肌酸，振摇试管后静置2 h，如出现红色，为VP试验阳性。将MR－VP培养物的剩余部分再培养48 h后，滴加5滴甲基红溶液。如培养物变红色，为甲基红试验阳性，若变黄色则为阴性反应。Koser氏枸椽酸盐试验:于36℃培养96 h记录有无生长。参照GB/T4789．4－2010方法，典型大肠杆菌与非典型大肠杆菌的生化鉴定标准见表1。

表1 典型大肠杆菌与非典型大肠杆菌的生化鉴定标准

1．2．4 PCR 鉴定

①大肠杆菌DNA提取 将分离到的19株大肠杆菌编号后无菌操作，接种到LB营养肉汤中，放置于恒温培养振荡器中，180 r/min振荡培养6～8 h。每株菌分别取1．0 mL LB营养肉汤大肠杆菌菌液加入1．5 mL灭菌的离心管中，13 000 r/min离心30 s，收集菌体。将菌体悬浮于0．5 mL TE缓冲液中，按试剂盒方法提取细菌基因组DNA，取提取产物2 μL进行电泳并记录电泳图谱。

②PCR扩增大肠杆菌16S rRNA 按照Fermentas公司PCR试剂盒的使用说明书，以基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增16S rRNA基因序列引物:正向引物5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′;反向引物 5′－ACGGCTACCTTGTTACGACTT－3′，扩增片段大小为 1 540 bp。

扩增反应为 25 μL 体系，其中 Dream TapTM Green PCR Master Mix 12．5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0．5 μL，模板(基因组 DNA)2 μL，Nuclease－Free Water 9．5 μL。PCR 反应程序:94 ℃预变性5 min;94℃变性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸10 min，循环扩增30次。扩增结束后取5 μL PCR产物用质量浓度为10 g/L的琼脂糖进行凝胶电泳检测。

③PCR扩增大肠杆菌stx基因 用细菌基因组DNA为模板，引物为:

stx2 上游引物 5′－GGCACTGTCTGAAACTGCTCC－3′

下游引物 5′－TCGCCAGTTATCTGACATTCTG－3′，扩增片段大小为 255 bp。

stx1 上游引物 5′－CGATGTTACGGTTTGTTACTGTGACAGC－3′

下游引物 5′－AATGCCACGCTTCCCAGAATTG－3′，扩增片段大小为 244 bp。

PCR 扩增体系为2 × Taq MasterMix 12．5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0．5 μL，DNA 模板2 μL，双蒸水加至总体系为25 μL。PCR反应条件均为94℃ 10 min，94℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 10 min，33个循环扩增。

2 结果与分析

2．1 不同食品种类大肠杆菌检测

经过检测，食品中大肠杆菌的总检出率为18．1%(19/105)。其中生猪肉的大肠杆菌检出阳性率为23．8%(5/21)，生鸡肉及其内脏的大肠杆菌阳性率为35．3%(12/34)，生鸡蛋的大肠杆菌阳性率为16．7%(2/12);生羊肉、生牛肉、生鸭蛋、生虾都没有检出大肠杆菌(表2)。

2．2 不同地区大肠杆菌检测

经过检测，秦皇岛市昌黎县和石家庄市藁城县的生猪肉，秦皇岛市昌黎县的生鸡肉，石家庄市的辛集市的生鸡蛋均有大肠杆菌存在(表3)。

表2 不同食品种类大肠杆菌检出率

表3 不同地区食品中大肠杆菌检出报告

2．3 大肠杆菌基因组DNA的提取

按照树脂型TM基因组DNA提取试剂盒说明书所述方法进行了上述19株食品源菌株基因组DNA的提取，得到了基因组DNA的条带(图1)，表明19株食品源菌株均成功提取到了其基因组DNA。

2．4 大肠杆菌PCR扩增

根据大肠杆菌16S rRNA基因序列的特异性引物，采用PCR方法，以大肠杆菌基因组DNA为模板扩增到了大小约1 540 bp的特异性条带(图2)，其大小与预期结果一致，19株食品源大肠杆菌均成功扩增并检测到大肠杆菌16S rRNA基因，与生化鉴定得到的结果一致。

图1 部分菌株基因组DNA

图2 PCR扩增16S rRNA

2．5 肠产志贺样毒素STEC的检测

根据肠产志贺样毒素大肠杆菌STEC的stx1和stx2基因序列特异性引物，以大肠杆菌基因组DNA为模板，采用PCR方法，对19株大肠杆菌进行stx1和stx2基因的检测，分别扩增得到了大小约255，244 bp的特异性条带(图3)，其大小与预期结果基本一致，表明成功扩增并检测到大肠杆菌stx1和stx2基因。检出的2株肠产志贺样毒素大肠杆菌分别编号为E1和E2。E1为stx2(255 bp)阳性，E2为stx1(244 bp)和stx2(255 bp)阳性，均分离自生鸡肉样品。

图3 PCR扩增stx1和stx2

3 讨 论

周建平［11］对从襄樊市的几个大型农贸市场随机抽检的60个样品中，生鸡肉大肠杆菌检出率为30%，生猪肉50%，生牛肉20%，熟肉类20%。王想霞等［12］在濮阳县及市城区集贸市场、超市和餐饮店采集生肉(猪、鸡、羊、牛肉)、散装熟肉、生食蔬菜、生牛奶等4类食品共计261份，检出了3种致病菌27株，其中O157:H7大肠杆菌7株。生肉类、熟肉类、生食蔬菜中大肠杆菌检出率分别为2．5%，1．4%，7．3%。在可生食蔬菜中(葱中检出3份，香菜中检出1份)检出率达7．3%，这类生食蔬菜(尤其是香菜)大部分为直接入口食品，如果在食用过程中清洗不彻底，极易引起O157:H7的暴发与流行。实验还显示，O157:H7夏季检出率明显高于秋季和冬季。马国柱等［13］于2002年对陕西省食品中食源性致病菌进行了监测，在5个监测点采集6类468份食品样本，按常规方法分离鉴定E．coli O157:H7。共分离到E．coli O157:H7 5株，从生奶中检出3株，生、熟牛肉中也各检出1株。其中，从生牛奶中检出具有stx2，hly，eae毒力基因1株，动物实验对小鼠致死。只帅等［14］于2006～2009年采自陕西省西安市及杨凌示范区各大超市和农贸市场全鸡、牛肉、猪肉、羊肉和凉拌菜样品357份，共分离出大肠杆菌748株，样品大肠杆菌总阳性率89%(319/357)，其中鸡肉、牛肉、猪肉、羊肉、凉拌菜的大肠杆菌细菌数与阳性样品数分别为:375株，87%(149/171);67株，84%(32/38);61株，88%(30/34);62 株，91%(30/33);183株，96%(78/81)。并从猪肉及羊肉源样品中分离到肠产志贺样毒素大肠杆菌2株。

本次试验按GB/T4789．4－2010方法分离培养细菌，结合生化试验和K－3401半自动微生物鉴定仪，采用国家标准法对抽样的肉类食品进行大肠杆菌的检测并进行PCR复核鉴定。2010年从河北省内不同地区抽查的105份肉样品中，生猪肉、生鸡肉、生鸡蛋的大肠杆菌阳性率分别为23．8%，35．3%，16．7%，生羊肉、生牛肉、生鸭蛋、生虾中没有检出大肠杆菌。从藁城县和昌黎县的生猪肉中分别检测出了1株和4株大肠杆菌，而在其他地区的食品样品中均未检出大肠杆菌，可能是由于肉品保存不当及卫生状况有关。秦皇岛市昌黎县是一个养殖密集区，饲养品种较多，从这次检测抽查的生鸡肉样品中检测到12株大肠杆菌，从石家庄市的辛集市的鸡蛋中检测出2株。与上述其他地区大肠杆菌检出率相比较有一定差异，可能与夏季采样的样品数量较多、夏季温度高有利于该菌的生长繁殖有关。由STEC引起的病案中有85%是通过食物而污染人体的［15］。本次试验还从19株大肠杆菌中共检测到2株STEC，检出率10．52%，低于丁红雷等［16］从326 份鲜奶中检出 STEC 的结果(14．42%)，高于 Altalhi等［17］的检出结果(9．1%)，说明检出率与样品种类、样品采样季节有一定差异。

通过本次试验，建议在食品加工制作及烹调过程中，对生肉、海产品要注意煮熟煮透，同时应防止交叉污染;其次，要养成良好的卫生饮食习惯，不要吃生腌的海产品。因为生腌的海虾、生蚝、螃蟹、蚶等食品，其盐腌过程很难杀灭所有的致病菌和寄生虫，很容易引发细菌性食物中毒的发生和其他食源性疾病的发生。再次，政府部门应加强经费投入，加强食源性疾病监测网络的建设和食源性致病菌的监测，以便能及时发现问题，适时提出预警和采取相应的预防与控制措施，防止食源性疾病的发生。

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