高效液相色谱法检测水产品中的孔雀石绿

万译文 ，洪 波，曾春芳，刘 丽 ，肖 维 ，黄华伟

（1.农业部渔业产品质量监督检验测试中心（长沙），湖南 长沙 410153；2.湖南省水产科学研究所，湖南 长沙 410153）

随着人们对食品安全要求的提高和国际贸易的发展，世界各国对食品检测的项目越来越多，对农药残留分析技术的灵敏度、特异性和快速性提出了更苛刻的要求。孔雀石绿是一种带有金属光泽绿色的结晶体，化学名称为四甲基代二氨基三苯甲烷，分子式（C23H25ClN2），易溶于水、甲醇、乙醇和戊醇，水溶液呈蓝绿色。它可用来作杀菌剂、驱虫剂，是药物染料中抗菌效力较强的一类，属于三苯甲烷类染料[1]。水产品中孔雀石绿的检测方法主要采用高效液相色谱法[2]及液质联用法[3-4]。目前国内检测孔雀石绿通常采用液相色谱－紫外检测器法（柱后衍生法）[5]，执行SC/T 3018-2004水产行业标准。此方法需要在色谱柱后连接二氧化铅氧化柱，把无色孔雀石绿转化成有色孔雀石绿，可以同时检测水产品中有色孔雀石绿和无色孔雀石绿的含量。大部分检测孔雀石绿采用国标GB/T 20361-2006，方法原理是将有色孔雀石绿经硼氢化钾溶液还原为无色孔雀石绿，然后用液相色谱法荧光检测器检测，这个方法大大降低了检测限，可以满足对欧盟及日本出口的条件。因此，我们在采用国标实验过程中将发现的问题进行了总结，并简化了试验步骤，节约了前处理时间，建立了高效液相色谱法检测水产品中孔雀石绿及其代谢物无色孔雀石绿的方法。采用该方法能得到较高的回收率和较低的检出限，在水产品痕量孔雀石绿的检测中具有广泛的应用前景。

1 材料与方法

1.1 试剂

孔雀石绿（分析纯，含量≥99.5%，上海哈姆科技有限公司公司）；乙腈（色谱纯，含量≥99.9%，美国TEDIA公司）；冰醋酸（优级纯，含量≥99.5%，天津科密欧公司）；乙酸铵（分析纯，含量≥98.0%，广东省化学试剂工程技术研究开发中心）；盐酸羟氨（分析纯，含量≥98.5%，湖南汇虹试剂有限公司）；对甲苯磺酸（分析纯，含量≥99.0%，湖南汇虹试剂有限公司）；二氯甲烷（分析纯，含量≥99.5%，湖南汇虹试剂有限公司）；二甘醇（分析纯，99.0%，成都金山化工试剂厂）；酸性氧化铝（分析纯，100～200目，国药集团化学试剂有限公司）。提取液：称取盐酸羟氨13.40 g，对甲苯磺酸0.84 g，乙酸铵0.48 g，混放入烧杯中用去离子水溶解，转移到500 mL的容量瓶中，用冰醋酸调节pH至4.5，定容。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱配RF-0AXL荧光检测器（日本岛津）；RE-52AA型旋转蒸发器（上海亚荣化仪器厂）；高速冷冻离心机（德国HEMEL公司）；XW-80A微型漩涡混合仪（上海沪西分析仪器厂）；电子天平（岛津国际贸易公司）。

1.3 标准溶液的配置

准确称取孔雀石绿0.010 g，用乙腈溶解，定容于100 mL容量瓶中，即得质量浓度为0.1 mg/mL的标准贮备溶液。使用时再用乙腈稀释成相应浓度的溶液。

1.4 液相色谱条件

色谱柱：ODS－C18柱，250 mm×4.6 mm，粒度 5 μm；流动相为 0.1 mol/L（pH 值 4.5）的乙腈：乙酸铵缓冲液（75∶25），流速为 1.0 mL/min；柱温为 35℃；激发波长265 nm，发射波长360 nm；进样量20 μL。

1.5 方法

1.5.1 提 取 称取处理好的样品约5.00 g置于50 mL离心管中，依次加入混合提取溶液20 mL、二甘醇2 mL、酸性氧化铝5 g，混匀。超声10 min，5 000 r/min离心10 min，取上清液至150 mL分液漏斗。继续向离心管中加入15 mL的乙腈，充分混匀，5 000 r/min离心10 min，取上清液并入150 mL分液漏斗中，重复一次。

在分液漏斗中加入15 mL的二氯甲烷，具塞，剧烈振摇2 min，静置分层，将下层溶液转移至100 mL鸡心瓶中。在分液漏斗再加入5 mL乙腈，10 mL二氯甲烷，振摇2 min，静置分层，将下层溶液并入鸡心瓶。45℃旋转蒸发至近干，用3 mL乙腈溶解残渣。

1.5.2 净 化 将PRS柱子接到固相萃取装置上，上端接中性氧化铝柱，先用5 mL的乙腈分两次活化柱子，转移提取液到柱上，然后用4 mL乙腈分两次洗涤鸡心瓶，每次2 mL，洗液加入0.1 mL硼氢化钾，轻轻振摇，依次过柱，弃去中性氧化铝柱，抽PRS柱近干，最后用3 mL洗脱液洗脱，过0.45 μm滤膜，供液相色谱测定。

2 结果与讨论

2.1 孔雀石绿标准曲线

配制一系列不同浓度的标准溶液0.001、0.002、0.010、0.040、0.100、0.200 μg/mL，测定的线性范围为 0.001～0.2 μg/mL，线性回归方程 Y=0.164 a+0.051 7，相关系数r=0.999 9，结果表明孔雀石绿在0.001～0.2 μg/mL范围内具有很好的线性，孔雀石绿标准曲线如图1所示。Kamila等[6]研究认为孔雀石绿和无色孔雀石绿溶液能在光照下降解，光氧化生成脱甲基化合物，而添加抗坏血酸能缓解降解过程。SC/T 3018-2004标准要求样品在前处理过程中尽量避光进行，也是由于孔雀石绿溶液的光降解特性。

图1 孔雀石绿校正曲线

2.2 最低检测限

取样量不同，方法的检出限也不同，本试验采用5 g的取样量，最后3 mL定容，以3倍噪音信号为最低检出浓度，求出最低检出限为0.5 μg/kg，可满足欧盟对我国水产品中孔雀石绿检测的要求（2 μg/kg）。

2.3 加标回收率的测定

在5 g草鱼、鲫鱼、鳙鱼样品中分别加入250、500和1 000 μL浓度为100 μg/L的孔雀石绿标准溶液（添加水平分别相当于 5、10、20 μg/kg），用玻棒搅匀，静置30 min，样品前处理后按方法所述中的色谱条件测定，对每个添加水平作5个平行，再重复2次，最后计算孔雀石绿的平均回收率和相对标准偏差，以分别考察方法的回收率和精密度。由表1可知，回收率为75.08%～95.13%，相对标准偏差为3.7%～7.1%。该加标回收率在70%～120%之间，相对标准偏差小于15%，符合检测要求。由图2可知，往空白样添加孔雀石绿标液5 μg/kg，孔雀石绿目标峰在色谱图中得到较好的分离并且峰形尖锐，回收率良好。

表1 回收率与精密度 （%）

图2 空白样品（A）和5 μg/kg加标样品（B）的色谱图

3 结论

用乙腈、乙酸铵缓冲溶液提取水产样品中孔雀石绿后，乙腈再提取，二氯甲烷反萃取；并结合匀浆、振荡提取、固相萃取等一系列提取净化步骤，成功地进行了水产品中孔雀石绿残留量的检测。该方法回收率较高，可用于水产品中孔雀石绿残留的批量检测，是水产品中孔雀石绿及其代谢物残留量快速而准确的检测方法。

[1]GB/T 19857-2005水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量和测定[S].

[2]孙贝贝，房文红.高效液相色谱技术在食品检测中的应用[J].安徽农业科学，2010，38（35）：20454-20456，20490.

[3]Peter S,Alder A B.Determination of residues of malachite green in finfish by liquid chromatography tandem mass spectrometry[J].Analytica Chimica Acta,2005，529:173-177.

[4]Luis V,Cecilia D,Andonia L Z,et al.Determination of the sum of malachite green and leucomalachite green in salmon muscle by liquid chromatography atmospheric pressure chemical ionisation mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A,2005,1067（1/2）:101-105.

[5]林 谦，林 炜，叶瑞洪.紫外可见分光光度法测定水产品中孔雀石绿含量[J].福建师范大学福清分校学报，2009，（5）：60-64.

[6]Kamilia M,Andrzej P,Jan Z.Determination of malachite green and leucomalachite green in carp muscle by liquid chromatography with visible and fluorescence detection[J].Journal of Chromatography A,2005，1089:187-192.