根霉紫外诱变菌株的性能及其发酵制作腊八豆的研究

孙继民 ，魏宝阳 ，谭炎宁 ，张逸妍 ，罗尊长 ，黄凤球

（1.湖南省土壤肥料研究所，湖南 长沙 410125；2.湖南农业大学园艺学院，湖南 长沙 410128；3.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128；

4.国家杂交水稻工程技术研究中心，湖南 长沙 410125）

腊八豆是我国传统发酵豆制品之一，它富含蛋白质、氨基酸和维生素，营养丰富，易于消化吸收，滋味鲜美，倍受人们喜爱；并且研究发现它具有大豆异黄酮、大豆多肽等功能性成分，有利于人们的健康[1-2]。传统方法制作腊八豆，是在自然环境条件下发酵酿制而成，可能产生黄曲霉毒素B1等有毒物质，还存在季节性强、生产周期长等问题。湖南农业大学微生物教研室于1997年首次利用毛霉菌M2为菌源，人工接种，人工调控发酵，在春季进行腊八豆产品的研制和生产试验。此法缩短了腊八豆的生产周期，扩大了生产量，取得了工业化生产的成功，为传统腊八豆的工业化、规模化、商品化生产奠定了基础[3-5]，但在发酵过程及腊八豆产品品质方面仍有些不尽如人意的地方。为适应市场需求，降低腊八豆生产成本，节省能源，需要选育出发酵性能高、能在中低温下快速发酵的菌株。紫外诱变是一种常规有效的菌株诱变育种方法，且操作简便，历年来的试验表明，80%的有效诱变是通过紫外诱变获得的。因此本研究以品质优良的高温根霉菌株8为出发菌株，经紫外线诱变，获得一生长性能良好、具有广温特性的菌株1。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

1.1.1 菌 种 8号菌株，湖南省土壤肥料研究所实验室保存。

1.1.2 仪 器 100套培养皿，若干支10 mL移液管，若干支1.0 mL移液管，100 mL锥形瓶若干个，250 mL锥形瓶若干，量筒，纱布，接种环，酒精灯，玻璃刮铲，红光灯，紫外灯，灭菌锅，恒温培养箱，磁力搅拌器，分光光度计。

1.2 培养基

菌株的培养选择马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基）。

1.3 试验方法

1.3.1 出发菌株的选育 菌株选择主要结合产品的色、香、味、形，一般要求它生长速度快、不产生有害物质、培养方便、酶系复杂（不仅含蛋白酶，还含有其他酶类），且酶活性高、发酵速度快，菌种纯、性能稳定，产品风味好。生产菌株8符合以上要求，可作为出发菌株。

在无菌操作下将试管根霉菌原菌株制成孢子悬浮液，并用无菌毛细管取孢子悬浮液点滴到无菌平板表面，每皿1～5滴，反转倒置于25～28℃温箱中培养24～72 h，每隔6 h观察1次，选取生长速度快、菌丝健壮、色泽一致、孢子形成快的单个菌落，挑取少许菌丝移入无菌试管斜面培养基上，在25～28℃恒温箱中培养4～5 d后，置冰箱内备用。

1.3.2 紫外光诱变 首先是在无菌条件下，从选好的腊八豆菌株中，用接种环挑取一定量孢子，放入无菌水中，震荡10 min左右；再用移液管移取该种菌液10 mL放入已灭菌的空白培养皿中。然后利用红灯照明和紫外光诱导，诱变时间分别为10、30、60、90、120、180、240 s，接种完毕用已灭菌玻璃刮铲涂匀，将培养皿放在黑暗和室温条件下培养3 d。1.3.3 菌株的筛选 将以上诱导各个时段生长良好的菌株，在无菌条件下，将这些菌和出发菌株分别接种到平皿培养基上，放置在室温下培养，仔细观察比较，选出优良菌株1。

1.3.4 淀粉酶活性测定 先配好淀粉培养基，再通过较高温灭菌后，快速倒好平板，制成淀粉酶培养皿。在无菌条件下，将1和8这两个菌的孢子分别接种在淀粉培养基上。每12 h观察一次，比较其生长速度、菌圈的大小。

1.3.5 氧气含量对菌株生长的影响 分别将诱变菌株1和出发菌株8接种在含大豆的水溶液和不用水泡的湿大豆中，置30℃温度条件下培养3 d，观察是否有菌丝生长及菌丝的生长量（每50 g干大豆所得干菌丝的重量）。

1.3.6 菌株遗传稳定性试验 将诱变所得菌株于真菌培养基上连续培养八代后，将之接入相同量煮熟的大豆上，比较第一代与第十代菌种在煮熟的50 g大豆（干重）、温度为20℃、培养时间3 d的菌丝生长速度和形成氨基酸的量。

1.3.7 氨基酸含量的测定 用出发菌株8和诱导菌1作对照试验放入28℃恒温箱中培养6 d，让其萌发长菌。制成腊八豆后，测其氨基酸含量。氨基酸中的自由氨基与水合茚三酮共热，产生紫色化合物，在一定范围内其颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，该有色物质在570 nm下有最大吸收。再用紫外光分光光度计测定未知样品中的氨基酸含量。

2 结果与分析

2.1 紫外诱变试验

2.1.1 紫外线诱变剂量的确定 选育了一株能在高温下（38℃）生长速度快、蛋白酶活性较高、菌丝粗壮，并处在相同生长期的优良菌株8，作为出发菌株，进行紫外线诱变。

试验选择 30、60、90、120、240 s等不同时间对孢子悬液进行紫外线照射，结果（如图1）显示，剂量为30 s的诱变，因存活率高、诱变率低、菌苔多，不易找到诱变株；剂量为240 s的诱变即使正变率较高，但它的存活率较低，所以都不宜选用。经过多次紫外线诱变试验发现，以稍高剂量进行紫外线诱变有利于获得目的菌株。在距离30 cm时，照射时间以120 s为佳；通过多次试验证明，此剂量是最佳诱变剂量，效果最好。

图1 紫外线照射时间与孢子死亡率的关系

2.1.2 紫外诱变结果 选取分别标记为：2′—01，2′—02，2′—03，2′—04，4′—01，8′—01，8′—02 的诱变菌株进行比较试验，发现2′—01在较低温度下，生长速度（以满管时间表示）和菌丝粗壮程度均优于其他菌株。因此，以该菌株作为目的菌株，命名为诱 1，见表 1。

表1 不同温度条件下诱变菌株的生长比较

2.2 淀粉酶活性测定结果

接种培养后，培养基上有菌株生长，原始菌株的淀粉酶活性为72.21 U/g，紫外线诱变后诱-1的71.76 U/g，说明它们都含有淀粉酶；诱变前后菌株的淀粉酶活性并无显著增加或减少，表明紫外线在诱变过程中并未引起形成淀粉酶基因发生改变。

2.3 氧气对菌株的影响

试验结果显示：菌株诱变前后在水中（缺氧条件）的生长远不及在空气中（有氧条件）生长得快、好；它们虽然都能在水中生长，但其生长量和生长速度明显受氧气的制约。这说明菌株在诱变前后都是好氧菌，氧气不足将直接影响菌株的生长发育，所以在生产过程中要注意保持氧气的持续供应。

表2 氧气对菌株生长发育的影响

2.4 诱变株的遗传稳定性

通过多次传代培养试验，发现在较低温和室温的条件下，诱1的长势要明显优于出发菌株8；在出发菌株8不生长的条件下，诱变菌株能很好地生长、发育和成熟。说明诱1的这种能在较低温下生长的性状是可以稳定遗传的，见表3。

表3 诱变株的遗传稳定性

2.5 腊八豆氨基酸含量的测定

将分别培养3 d和6 d的腊八豆称量、磨碎、定容、过滤，然后用可见光分光光度计测得氨基酸含量，结果表明：用出发菌株发酵3 d和6 d后的腊八豆的氨基酸含量分别为1.178 mg和1.578 mg；用诱导菌株发酵3 d和6 d后的腊八豆的氨基酸含量分别为5.814 mg和17.54 mg。可见诱变后菌株不仅温度适应性强，而且它的蛋白酶活性也得以提高，用其发酵，制作的腊八豆品质也将有较大提高。

3 讨论

民间传统方法是无法大量生产腊八豆的，因为毛霉的最适生长和发酵的温度很低，而夏季温度高，且自然环境中其他微生物的种类和数量是一年中最多的，同样也是它们生长繁殖最旺盛的季节。然而通过对根霉的紫外线诱变，选育出了诱变菌株1，并与出发菌株在相同条件下进行对比试验，发现诱变菌株在较低温度下，能够保持稳定的较快生长速度，同时，诱变菌株可以更好地分解黄豆中的蛋白质使蛋白质的转化率升高，大大提高了腊八豆的营养价值。这样，有利于腊八豆的工业化生产，并为其工业化生产提供了更为经济、实用、方便的优良菌株。从微生物生态、生物学特性笔者发现，发酵前期主要是根霉菌体的生长和蛋白酶形成，发酵后期主要利用根霉分泌蛋白酶使蛋白质分解为各级肽类、氨基酸。由于根霉产生的淀粉酶在后发酵时能够将黄豆中少量的碳水化合物分解成低分子物质，增强了腊八豆的风味，改善了腊八豆的品质，且根霉的发酵温度较高，避免了腊八豆生产的季节限制，提高劳动生产率及设备利用率。利用根霉代替毛霉发酵制作腊八豆从工艺上是完全可行的，同毛霉比有其更大的优势。诱变菌株1是广温菌，可以克服出发菌株的高温生长特性，更加有利于腊八豆的工业化生产。

如果能利用好根霉和毛霉各自的优点，用纯种根霉与纯种毛霉共同发酵，这样可能得到的腊八豆风味更好，营养价值更高；利用诱变菌株1生产腊八豆是否对腊八豆有其他方面的影响，还有待于进一步研究。

[1]邬玉香，夏延斌，刘爱玲.大豆异黄酮在腊八豆生产中的稳定性[J].湖南农业大学学报，2002，（3）：237-238.

[2]潘志芬，潘开文.加工对大豆异黄酮的影响[J].食品研究与开发，1999，20（1）：38-39.

[3]钱存柔，黄仪秀.微生物学实验教程[M].北京：北京大学出版社，2000.

[4]杜秉海.微生物学实验[M].北京：北京农业大学出版社，1997.

[5]夏岩石，夏延斌，蒋立文，等.利用毛霉与根霉共生发酵生产腊八豆的研究[J].食品工业科技，2005，26（1）：96-98.