锌锰拮抗SiO2对中国仓鼠肺成纤维细胞DNA交联的实验研究＊

周 敏，谈伟君，庞雅琴，李 阳

（1.广西右江民族医学院预防医学系，广西百色533000；2.广东药学院食品科学学院，广州510060）

锌、锰是机体必需的微量元素，参与体内多种酶的构成，在清除自由基方面有重要作用［1－3］。作者前期研究证明锌、锰在体外有一定的拮抗二氧化硅（SiO2）粉尘致细胞DNA损伤作用［4－5］。本文采用溴化乙锭（EB）荧光法测定DNA交联作用，进一步探讨葡萄糖酸锌（ZnG）、氯化锰（MnCl2）单独及联合应用拮抗SiO2对中国仓鼠肺成纤维细胞（Chinese hamster fibroblast cell line，CHL）的损伤作用，并寻找二者的最佳剂量组合。

1 材料与方法

1.1 材料 标准SiO2粉尘（中国预防医学科学院提供，游离SiO2的含量大于97%，粉尘粒径小于5μm占95%）；CHL系购自上海细胞研究所；ZnG（广东制药厂生产的ZnG片）；MnCl2（上海金山兴塔美兴化工厂生产的分析纯）；RPMI1640培养液；消化缓冲液：10mmol／L三羟甲基氨基甲烷（Tris），25 mmol／L乙 二 胺 四 乙 酸 （EDTA），100mmol／L NaCl，pH＝7.9，10%十二烷基磺酸钠（SDS），0.1mg／mL蛋白酶 K（临用前加）；EB缓冲液：20mmol／L K2HPO4，2mmol／L EDTA，1 μg／mL EB。

CO2培养箱 Heal Force Development公司产品，型号：BB5060UV；紫外分光光度计，Cambridge公司产品，型号：78062；荧光分光光度计，日本岛津Shimazu公司产品，型号：RF－540。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 取生长良好的CHL，以5×108个／L的密度接种到细胞培养瓶中，经24h培养后进行实验，实验分为对照组（生理盐水，不加SiO2）；SiO2（100μg／mL）组；ZnG（2.25 μg／mL）组；MnCl2（1.5μg／mL）组；SiO2＋ZnG组（培养液除含100μg／mL SiO2外，分别含 ZnG 1.00、1.50、2.25μg／mL）；SiO2＋MnCl2组（除含100μg／mL SiO2外，分别含 MnCl20.25、0.50、1.00μg／mL）；ZnG和 MnCl2联合作用组（每组除含SiO2100mg／L外，采用析因设计，ZnG＋MnCl2共设9个浓度组，染毒2h）。

1.2.2 酚提法提取细胞DNA 加入细胞消化液600μL，56℃水浴过夜，用等体积饱和酚－氯仿异戊醇溶液反复抽提，取上清液，加入100%冰乙醇沉淀DNA，并用70%乙醇洗2次，室温晾干，干燥的DNA用适量双蒸水溶解，待用。

1.2.3 DNA 交联的测定［6－8］采用EB荧光法。DNA交联率的计算按下述公式：

ct%＝（变性DNA荧光－空白荧光）／（未变性DNA荧光－空白荧光）×100%。式中空白荧光为EB缓冲液的荧光强度。

1.3 统计学处理 实验数据应用SPSS13.0软件进行完全随机设计资料的单因素方差分析和析因设计资料的方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ZnG拮抗SiO2对CHL的DNA交联作用 100μg／mL的SiO2可引起CHL DNA交联率明显升高（与对照组比，P＜0.05），2.25μg／mL的ZnG对未染尘的 CHL DNA交联作用与对照组比较无明显变化（P＞0.05）。在染尘CHL中加入不同浓度的ZnG（1.00、1.50、2.25μg／mL）后，DNA交联率明显下降（与SiO2组比较，P＜0.05），随着ZnG的浓度增加，DNA交联率越低，见表1。

表1 ZnG拮抗SiO2对CHL DNA的交联作用（±s，n＝6）

表1 ZnG拮抗SiO2对CHL DNA的交联作用（±s，n＝6）

＊：P＜0.05，与对照组比较；＃：P＜0.05，与SiO2组比较。

组别DNA交联率（%）对照组 4.72±0.85＃SiO2（100μg／mL）组 17.73±0.94＊ZnG（2.25μg／mL）组 4.61±0.89＃SiO2（100μg／mL）＋ZnG（1.00μg／mL）组 14.77±0.75＊＃SiO2（100μg／mL）＋ZnG（1.50μg／mL）组 12.18±0.68＊＃SiO2（100μg／mL）＋ZnG（2.25μg／mL）组 9.12±0.61＊＃

2.2 MnCl2拮抗SiO2对CHL的DNA交联作用 100μg／mL的SiO2可引起CHL DNA交联率明显升高（与对照组比，P＜0.05），1.00μg／mL的 MnCl2对未染尘的CHL DNA交联作用与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。在染尘CHL中加入不同浓度的 MnCl2（0.25、0.50、1.00μg／mL）后，DNA交联率明显下降（与SiO2组比较，P＜0.05），随着MnCl2的浓度增加，DNA交联率越低，见表2。

表2 MnCl2拮抗SiO2对CHL的DNA交联作用±s，n＝6）

表2 MnCl2拮抗SiO2对CHL的DNA交联作用±s，n＝6）

＊：P＜0.05，与生理盐水对照组比较；＃：P＜0.05，与SiO2 组比较。

组别DNA交联率（%）对照组 4.72±0.85＃SiO2（100μg／mL）组 17.73±0.94＊MnCl2（1.00μg／mL）组 4.71±0.84＃SiO2（100μg／mL）＋MnCl2（0.25μg／mL）组 15.17±0.72＊＃SiO2（100μg／mL）＋MnCl2（0.5μg／mL）组 11.88±1.02＊＃SiO2（100μg／mL）＋MnCl2（1.0μg／mL）组 9.00±0.83＊＃

表3 ZnG与MnCl2联合应用拮抗SiO2对CHL的DNA交联作用（±s，n＝6）

表3 ZnG与MnCl2联合应用拮抗SiO2对CHL的DNA交联作用（±s，n＝6）

＊：P＜0.05，与对照组比较；＃：P＜0.05，与SiO2 组比较。

组别DNA交联率（%）对照组 4.72±0.85＃SiO2（100μg／mL）组 17.73±0.94＊SiO2（100μg／mL）＋ZnG（1.00μg／mL）＋MnCl2（0.25μg／mL）组 13.24±0.82＊＃SiO2（100μg／mL）＋ZnG（1.00μg／mL）＋MnCl2（0.5μg／mL）组 13.16±1.42＃SiO2（100μg／mL）＋ZnG（1.00μg／mL）＋MnCl2（1.0μg／mL）组 13.01±1.48＊＃SiO2（100μg／mL）＋ZnG（1.50μg／mL）＋MnCl2（0.25μg／mL）组 12.87±0.47＊＃SiO2（100μg／mL）＋ZnG（1.50μg／mL）＋MnCl2（0.5μg／mL）组 8.32±0.85＊＃SiO2（100μg／mL）＋ZnG（1.50μg／mL）＋MnCl2（1.0μg／mL）组 12.52±0.28＊＃SiO2（100μg／mL）＋ZnG（2.25μg／mL）＋MnCl2（0.25μg／mL）组 12.51±1.35＊＃SiO2（100μg／mL）＋ZnG（2.25μg／mL）＋MnCl2（0.5μg／mL）组 12.15±1.08＊＃SiO2（100μg／mL）＋ZnG（2.25μg／mL）＋MnCl2（1.0μg／mL）组 11.87±0.95＊＃

表4 ZnG与MnCl2联合对DNA交联作用影响的方差分析

2.3 ZnG与MnCl2联合应用拮抗SiO2对CHL的DNA交联作用 100μg／mL的SiO2可引起CHL DNA交联率明显升高（与对照组比，P＜0.05），析因设计方差分析结果表明，ZnG和MnCl2的交互作用差异具有统计学意义（P＜0.05），见表3、4。在染尘CHL中加入1.50μg／mL的ZnG与0.50μg／mL的MnCl2时，拮抗SiO2对CHL DNA交联的联合作用效果最好。

3 讨 论

实验结果显示，SiO2可引起CHL DNA交联率明显升高，在染尘CHL中加入不同浓度的ZnG、MnCl2后，DNA交联率明显下降。

锌、锰对DNA损伤的保护作用机制涉及多方面［9－11］：锰与DNA、RNA、蛋白质的合成关系密切，是其合成过程中多种酶的组成成分和激活剂；可与DNA带负电荷的磷酸基团产生稳定作用而维持DNA的二级结构，防止结构的突变；还可构成Mn－SOD，可抵抗自由基对DNA的攻击。锌是核酸的丰富组分，能稳定RNA、DNA、和核糖体的结构，锌可通过键合于DNA骨架链上的磷酸基团和核苷的碱基而稳定双螺旋结构。

本实验采用析因设计研究ZnG与MnCl2联合应用拮抗SiO2对CHL的DNA交联作用，方差分析结果表明，ZnG与MnCl2的交互作用差异具有统计学意义，在染尘CHL中加入1.50μg／mL的ZnG与0.50μg／mL的 MnCl2联合作用时，拮抗SiO2对CHL DNA交联的效果最好。二者联合拮抗SiO2致细胞DNA损伤的作用机制可能是它们共同抗氧化的结果。

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