苦参素对肝脏纤维化的抑制作用

张建荣 刘志刚 李玉芳 李丽华

苦参素(Oxymatrine)是从中药广豆根中分离所得的生物碱类，具有抗炎，抗菌，抗病毒，抑制免疫，抗肿瘤等生物学作用［1］。临床实践证实，苦参素可以阻止甚至逆转肝脏纤维化，但其作用机制及调节途径尚不明确。肝纤维化(hepatic fibrosis)是机体对慢性肝损伤的一种修复反应，是一种渐进的病理过程，是慢性肝病的共有病理变化，是多种类型细胞、氧化应激、细胞因子和生长因子等一系列复杂作用的结果。肝纤维化的特征改变是肝脏内细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)的过度增生和异常沉积，严重者的肝纤维化可导致肝硬化，甚至引起肝功能衰竭［2］。肝纤维化已成为一个危害人类生命健康的世界性问题。目前从肝纤维化发生发展的不同环节入手研制了许多抗纤维化药物，但仍未有十分确定、特效的药物，因此，寻找理想的抗肝纤维化药物及有关肝纤维化发病机制的阐明，具有重要的理论和临床意义。本研究利用四氯化碳(CCl4)制作大鼠肝纤维化和肝硬化动物模型，通过苦参素干预来探讨苦参素抗肝纤维化作用的作用机制，为苦参素的临床防治肝纤维化提供了新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性Wistar大鼠40只购自河北医科大学实验动物中心，体重200 g，随机分成4组，即正常对照组(Con组)和5%乙醇自来水溶液饮用组(Veh组)，60% 的CCl4处理组(CCl4组)和苦参素干预组(Oxy组)，每组10只。

1.2 模型制作 CCl4组给予60%CCl4溶液皮下注射结合5%乙醇自来水溶液饮用，每只0.3 m l/100 g，1次/d，共14周，制作大鼠肝纤维化和肝硬化动物模型;Oxy组在给予CCl4的同时肌肉注射60 mg/kg苦参素;Veh组饮用5%乙醇自来水溶液;Con组和Veh组每周背部皮下注射0.9%氯化钠溶液。

1.3 HE染色观察肝组织变化 每组取5只大鼠，用10%的水合氯醛按300 mg/kg腹腔麻醉动物，4%多聚甲醛经心-升主动脉灌注固定，然后30%蔗糖液中至组织块沉底，石蜡包埋，切片，常规HE染色。

1.4 Western blot法测I、Ⅲ型胶原和MMP-13蛋白的表达 每组取5只大鼠，取部分肝组织入4℃裂解液匀浆5 min，4℃离心，取上清，Bradford法测定样本蛋白浓度。样本蛋白经12%SDS-PAGE凝胶电泳分离，转移至PVDF膜，脱脂奶粉室温封闭2 h，1∶300稀释的collagenⅠ，Ⅲ抗体和MMP13抗体4℃过夜，二抗(1∶3 000稀释)与硝酸纤维素膜杂交。将膜置于ECL中1 min，曝光，显影，定影。采用美国Kodak公司ID数码成像分析系统软件对Western blot结果进行定量分析，结果以目的蛋白与β-actin的积分光密度值的比值表示。

1.5 统计学分析应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以±s表示，采用组间SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色结果 Con组和Veh组大鼠肝组织肝小叶结构完整，肝板条索状以中央静脉为中心呈放射状排列，肝细胞无变性、坏死;CCl4组大鼠肝细胞溶解，弥漫性大片坏死，残留肝细胞成片气球样变;肝细胞呈小灶状坏死明显多于Con组和Veh组，苦参素干预组大鼠的肝细胞结构形态明显好于CCl4组大鼠。

2.2 Western blot法测 I、Ⅲ型胶原和 MMP-13蛋白的表达Con组与Veh组三种蛋白的表达无明显变化。与Con组相比，CCl4组大鼠的CollagenⅠ，Ⅲ的表达显著增加，MMP-13的表达显著降低，差别有统计学意义，表现为CCl4组大鼠的CollagenⅠ，Ⅲ的累积光密度与β-actin的比值比Con组分别提高了53.51%(P ＜0.01)和59.57%(P ＜0.01)，MMP-13 的累积光密度与β-actin比值降低了33.53%(P ＜0.01)。苦参素处理后CollagenⅠ，Ⅲ的表达显著降低，MMP-13的表达显著则增加，表现为Oxy组大鼠的CollagenⅠ，Ⅲ的累积光密度与β-actin的比值比 CCl4组大鼠分别降低了26.66%(P ＜0.01)和30.75%(P＜0.01)，MMP-13的累积光密度与 β-actin比值增加了38.43%(P ＜0.01)。苦参素处理后CollagenⅠ，Ⅲ的表达没有降低到Con组水平，而MMP-13增加到了Con组水平。见表1。

表1 4组大鼠CollagenⅠ，Ⅲ及MMP-13，TIMP-13与β-actin比值比较n=5，±s

表1 4组大鼠CollagenⅠ，Ⅲ及MMP-13，TIMP-13与β-actin比值比较n=5，±s

注:与 Con 组比较，*P ＜0.05，#P ＜0.01;与 CCI4组比较，△P ＜0.01

MMP-13 Con组组别 CollagenⅠ CollagenⅢ1.2532 ±0.1181 1.5089 ±0.0788 1.8083 ±0.0891 Veh 组 1.2839 ±0.0936 1.5036 ±0.0846 1.7800 ±0.1532 CCl4组 1.9238 ±0.0581# 2.4078 ±0.0822# 1.2020 ±0.1313#Oxy组 1.4109 ±0.0848＊△ 1.6674 ±0.0515#△ 1.6639 ±0.0437△

3 讨论

本研究通过HE染色和Western blot法显示，CCl4处理组大鼠能够引起大鼠肝纤维化和肝硬化，肝细胞溶解，弥漫性大片坏死，CollagenⅠ，Ⅲ的表达增加，MMP-13的表达降低。苦参素处理后大鼠的肝细胞结构形态明显好转，CollagenⅠ，Ⅲ的表达显著降低，MMP-13的表达显著增加，提示苦参素对肝纤维化具有抑制作用。

肝纤维化是一种可以逆转的疾病，然而在临床实践中还没有一种满意的方法来逆转肝纤维化的病理过程。近年来一些药物，如antisense TGFβreceptor，细胞活素类，抗氧化剂，soluble typeⅡreceptor of TGFβ1，antibody of TGFβ1等用于肝纤维化的实验研究，但均未达到理想的效果。研究显示，肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)的激活认为是肝纤维化过程中最重要的一步［3］。肝纤维化发生的主要机制是肝细胞外基质(ECM)的过度增多和异常沉积。细胞外基质包括胶原，糖蛋白及蛋白多糖等，其中胶原是最主要的成分。在肝脏中有Ⅰ型，Ⅲ～Ⅵ型共5型，而以Ⅰ型和Ⅲ型为主。肝纤维化早期胶原沉积以Ⅲ型为主，后期以Ⅰ型为主。调控胶原代谢的关键酶是基质金属蛋白酶(MMPs)，其中MMP13是基质金属蛋白酶家族中对肝脏胶原降解作用较强的酶［4］。

因此，本研究推测，苦参素作为一种中药提取剂能够增加MMP13的表达，抑制HSC的激活，减少CollagenⅠ，Ⅲ的合成，缓解肝纤维化过程。此外，苦参素能保持肝星状细胞的增殖/凋亡的平衡，可以减少细胞外基质的产生，起到抗肝纤维化作用，这为苦参素的临床防治肝纤维化提供了新的理论依据。

1 李丹，王平金，张楠森.苦参碱类生物碱的研究进展及临床应用.中草药，1996，27:308-311.

2 Fallowfield J，Hayes P.Pathogenesis and treatment of hepatic fibrosis:is cirrhosis reversible.Clin Med，2011，11:179-183.

3 Reeves HL，Friedman SL.Activation of hepatic stellate cells--a key issue in liver fibrosis.Front Biosci，2002，7:808-826.

4 孙妩弋，桂双英，吴丽，等.芍芪多苷对肝纤维化大鼠肝脏星状细胞基质金属蛋白酶13及组织金属蛋白酶抑制因子1表达的影响.中国中药杂志，2010，35:1447-1451.