硫脲壳聚糖Zn(II)配合物的制备、表征及生物活性

冯小强，李小芳，杨 声，张景峰

天水师范学院生命科学与化学学院，天水741001

硫脲壳聚糖Zn(II)配合物的制备、表征及生物活性

冯小强*，李小芳，杨 声，张景峰

天水师范学院生命科学与化学学院，天水741001

利用FT-IR、UV、TG-DTA和XRD手段，对合成的硫脲壳聚糖及硫脲壳聚糖-Zn(II)配合物进行了表征，研究了壳聚糖、硫脲壳聚糖及硫脲壳聚糖-Zn(II)配合物对细菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和真菌黑曲霉的抑菌性能。结果表明:合成的硫脲壳聚糖-Zn(II)配合物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌性能比单一的壳聚糖、硫脲壳聚糖显著提高，对真菌黑曲霉亦具有较强的抑制作用。

壳聚糖;硫脲壳聚糖-Zn(II)配合物;制备;抑菌性能

Abstract:Thiourea-chitosan-Zn(II)complex was prepared and characterized by FT-IR，UV-Vis absorbance spectra，XRD and TG-DTA methods.The antimicrobial activities of chitosan，thiourea-chitosan and thiourea-chitosan-Zn(II)complex against Escherichia coli，Staphylococcus aureus and Aspergillus niger were investigated in vitro.The results showed that the antimicrobial activity of thiourea-chitosan-Zn(II)complex obviously enhanced compared to the chitosan and thiourea-chitosan，which can effectively inhibit the growth of Aspergillus niger.

Key words:Chitosan;Thiourea-chitosan-Zn(II)complex;Preparation;Antimicrobial activity

壳聚糖(Chitosan，简称CS)具有无毒、生物相溶、可降解、抑菌等特性，在医学、食品营养学、环境保护、轻工业等领域有着极为广泛的应用。与一般抑菌剂相比，它具有抑菌活性高、广谱、杀灭率高和无毒等优点［1］。由于壳聚糖分子链中有大量羟基、氨基及N-乙酰氨基，这种特殊的结构使壳聚糖通过氢键或盐键形成具有类似网状结构的笼形分子，从而对金属和稀土离子有着稳定的配位作用。硫脲化合物螯合金属非常有效，广泛应用于金属的提取［3］。壳聚糖新型衍生物硫脲壳聚糖对金属离子亦有着稳定的配位作用，并且金属离子具有抗炎、杀菌、抗癌、抗凝血等药理作用［2］，形成的配合物以期为高活性的抗菌剂。

对于硫脲壳聚糖与金属离子配合物的研究不多。Chen等发现硫脲壳聚糖中的S原子和O原子参与了与Ag+的配位，且硫脲壳聚糖-Ag+具有很强的抑菌活性，最小抑菌浓度较壳聚糖降低20倍［4］。本实验合成了硫脲壳聚糖(TUCS)，选择了金属离子Zn2+与 TUCS配位，采用 FT-IR、UV、DG-DTA 和XRD分析手段，并对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和真菌黑曲霉的抑菌性能进行了比较研究。该研究为CS及其衍生物的临床应用提供更加充分的实验依据，并扩大了CS在医药和食品工业等领域的广泛应用。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

壳聚糖(浙江玉环壳聚糖有限公司，Mw=50 kDa，DD.90%)，用 1.0%(v/v)HAc 溶解。大肠杆菌(Escherichia coli，ATCC 35218)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，ATCC 26113)、黑曲霉(Aspergillus niger)均由天水市中医院化验科提供。

UV-9200型紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司);Spectrum One傅立叶红外光谱仪(Perkin Elmere);Perkin Elmere TG-DTA分析仪(Pyris Diamond Analyzer)。

1.2 TUCS 的制备

将3.4 g的硫脲和3.0 g CS及30 mL的无水乙醇加入到三颈烧瓶中，温度控制在65℃，回流搅拌12 h，产物冷却至室温，过滤、反复用乙醇洗涤，将过滤物溶解于100 mL的1%(v/v)乙酸溶液，加入10%(w/v)氢氧化钠溶液进行过滤，收集沉淀，用水洗净、干燥，得到 TUCS，产率为 85%［4］。

1.3 TUCS-Zn配合物的制备

在装有0.5 g TUCS的锥形瓶中加入40 mL体积分数0.5%的乙酸溶液，在水浴振荡器中振荡1 h，待 TUCS 充分溶解后，加入0.1 g ZnCl2，用10%的HCl调节pH至4.5，控温反应4 h后，加入200 mL丙酮溶液析出产物，充分洗涤并过滤，再用无水乙醇充分洗涤、过滤，真空干燥，得到白色产物，产率为67%。

1.4 TUCS-Zn配合物表征

采用KBr压片，测定 CS、TUCS及 TUCS-Zn的红外光谱;用1%(v/v)乙酸溶解配制1 mg/mL的CS、TUCS和TUCS-Zn溶液，于200～500 nm波长范围内测定紫外吸收光谱;以α-Al2O3为参比，升温速率10 ℃ /min，对 CS、TUCS、TUCS-Zn 进行热力学分析;采用XRD-6000粉末衍射仪，Kα射线，Zn靶，扫描范围:0-40(2θ)，电压40 kV，电流30 mA。

1.5 TUCS-Zn配合物抑菌活性及最低抑菌浓度的测定

抑菌圈法是将含有定量抗生素的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加抗生素的浓度呈对数减少，在药物浓度到达的范围内对此药敏感的细菌不能生长而形成透明的抑菌圈，以抑菌圈的直径作为评定指标，抑菌圈直径越大，说明该抑菌剂对此种供试菌的抑制效果越好，反之则抑制效果越差。将E.coli和St.aureus接种于牛肉膏固体培养基，37℃活化24 h，制成菌悬液备用。取直径6 mm已灭菌的圆滤纸片浸泡在浓度均分别为10、5、2.5 mg/mL的TUCS-Zn、TUCS和CS溶液中(1.0%乙酸溶解)。取0.1 mL菌悬液涂布在培养基平板上，尔后用无菌镊子夹取浸泡过的圆滤纸片贴于培养皿中，每皿贴5片。以1.0%的HAc溶液作为空白对照。37℃恒温培养24～48 h，测定抑菌圈直径。

将真菌 A.niger接种于马铃薯琼脂培养基(PDA)，在27℃下活化72 h，用已灭菌的打孔器打直径为0.8 cm 的菌片备用。CS、TUCS、TUCS-Zn与一定量PDA混合，使CS、TUCS及TUCS-Zn的最终浓度为 0.5、1.0、1.5 mg/mL，以等体积的 1.0%HAc溶液作为空白对照，三氯生为阳性对照，灭菌后倒平板，待冷却后在培养皿中央贴一菌片，置于恒温培养箱27℃培养，观察A.niger菌丝体生长情况，直到对照组黑曲霉菌落几乎长满培养皿为止。

本实验采用菌落平板记数法测定CS、TUCS、TUCS-Zn的最低抑菌浓度(MIC)。固体培养基和一定浓度的药物混合，使药物最终浓度分别为0、0.0625、0.125、0.25、0.5、0.75、1.0 和 1.5 mg/mL，灭菌倒平板，取0.1 mL稀释至OD610=0.001的菌悬液涂布在培养基平板上，E.coli和St.aureus在37℃下恒温培养，A.niger在27℃下恒温培养，以肉眼观察不到菌落对应的浓度即为CS、TUCS、TUCS-Zn对 E.coli、St.aureus和 A.niger的 MIC。

2 结果与讨论

2.1 TUCS-Zn配合物表征

2.1.1 红外光谱

CS、TUCS和TUCS-Zn的红外光谱如图1所示。CS中位于3446 cm-1左右的N-H，O-H缔合峰形，改性后发生位移且峰形变窄;CS原位于1664 cm-1处较强的酰胺吸收峰和1599 cm-1左右的-NH2面内弯曲振动吸收峰，在TUCS中分别位移至1638 cm-1和1616 cm-1处，峰形变窄;且TUCS在1493 cm-1处出现一弱的新峰，表明在CS结构中的-NH2引入硫脲基团［5］。与TUCS相比，TUCS-Zn的红外光谱在848、916、950、990 cm-1出现新的吸收峰，归属为 S-Zn 伸缩振动峰。

图1 CS、TUCS和TUCS-Zn的红外光谱Fig.1 IR spectra of chitosan，thiourea chitosan and thiourea chitosan-Zn

2.1.2 紫外光谱

CS、硫脲、TUCS、TUCS-Zn的紫外光谱如图2 所示。CS、TUCS、TUCS-Zn 分别在 224.50、235.00、234.00 nm有强吸收峰，这是由于配合物中氮、氧的孤对电子发生n→σ*跃迁和π→π*跃迁，导致电子光谱发生的变化所致，且在同一浓度下，TUCS-Zn的吸收强度高于CS和TUCS。表明配位作用发生。

2.1.3 差热-热重分析

CS、TUCS和 TUCS-Zn的 TG-DTA曲线如图3所示。CS的降解分为两个阶段:第一个阶段在80℃开始，失重10%，主要是失去水分子;第二个阶段失重在250℃开始，到500℃失重达最大，失重55%，在230℃有一强的放热峰，TG曲线上表现为一个显著的失重变化;最终分解温度688℃。TUCS热分析表明，随着失重的进行，差热曲线出现多个放热峰，是TUCS分解、氧化、燃烧的结果。在98.2℃～150℃之间有明显失重并伴有2个低矮的放热峰，失重达4.7%，当温度升至245℃左右有一强的放热峰，峰形尖而高，与之相应的热重线又有明显的失重拐点。这是由于TUCS减弱了壳聚糖分子的规整度和氢键网络，从而降低了壳聚糖的结晶程度，导致分解温度降低;对于TUCS-Zn，当温度升至217℃左右有一强的放热峰，峰形尖而高，与之相应的热重线又有明显的失重拐点。可能是由于TUCS与Zn2+配位后，其分子内的氢键结合被破坏，结晶度发生改变，热稳定性减小。这种结构稳定性变化表明，TUCS与金属离子配合后，分子中不同金属离子与含有孤对电子的活性基团-NH2、-OH的配合作用，不仅改变了聚合物的部分化学键性质及其原子之间的相互作用，必然要改变它们的稳定的空间构象［6］，进而此次级转变的转变温度略有降低，它们的不稳定性是由于缺少自由的氨基，在制备衍生物时氨基被取代，而CS因其有自由的氨基而更稳定。

图2 CS、硫脲、TUCS、TUCS-Zn 的紫外光谱(1-硫脲，2-CS，3-TUCS，4-TUCS-Zn)Fig.2 UV spectrum of chitosan，thiourea，thiourea chitosan，thiourea chitosan Zn(II)

图3 CS、TUCS和TUCS-Zn的TG-DTA 曲线Fig.1 TG-DTA curves of chitosans(A)，thiourea chitosan(B)，and thiourea chitosan-Zn(II)complexes(C)

2.1.4 X-射线衍射

图4 为CS、TUCS和TUCS-Zn的X衍射谱图。CS 在2θ 为10.4°和19.8°处出现 2 个特征衍射峰，呈现“L-2 polymorph”晶型衍射图。TUCS在这两处的衍射峰强度显著减弱，是由于TUCS减弱了CS分子的规整度和氢键网络，从而降低了CS的结晶程度。TUCS-Zn在10.4°和 19.8°处的衍射峰几乎消失，出现新的衍射峰，表明有规则的结晶相形成［7］。采用elementar Vario EL元素分析仪测得C%(38.1)，H%(6.42)，N%(8.42)，S%(0.4)，WF-110B原子吸收光谱仪测得Zn(Ⅱ)%(9.85)。

图4 CS(a)、TUCS(b)和TUCS-Zn(c)的X衍射谱图Fig.4 XRD of chitosans(a)，thiourea chitosan(b)，and thiourea chitosan-Zn(II)complexes(c).

2.2 抑菌实验

抑菌圈直径越大，说明该抑菌剂对此种供试菌的抑制效果越好，反之则抑制效果越差。不同浓度CS、TUCS 和 TUCS-Zn对 E.coli和 St.aureus对应的抑菌圈直径如表1所示。可以看出，CS、TUCS和TUCS-Zn作用 E.coli和 St.aureus后，均具有明显的抑菌圈，且随着样品浓度的增加，与对照组相比抑菌圈的直径逐渐增加;TUCS-Zn的抑菌圈直径比单一的CS、TUCS显著增大，说明 TUCS-Zn对 E.coli和St.aureus的生长有较好的抑制作用。TUCS和金属锌离子配位后，虽然一定程度上破坏了结构中的-NH2的阳离子化，使消毒因子-NH3+减少，但分子表面正电荷密度增加，从而增强了聚阳离子吸附到带负电荷的细菌表面的能力，并且Zn2+具有较多的核外电子和较小的离子半径，与TUCS结合作用很强，具有高电子密度的TUCS-Zn配合物更容易和细菌表面作用进而显示更强的抑菌效果。且Zn2+也具很强的抑菌性能，故TUCS-Zn配合物的抑菌性能较CS、TUCS远远增强。

表1 CS、TUCS和TUCS-Zn对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈Table 1 Bacteriostasis-diameter of CS，TUCS and TUCS-Zn(II)against E.coli and St.aureus

TUCS-Zn配合物对黑曲霉生长的影响如表2所示。当黑曲霉培养第4 d时，对照组黑曲霉菌落的径向生长十分旺盛，菌落覆盖了整个培养皿，有大量呈炭黑色的孢子生长繁殖。在培养基中加入壳聚糖、TUCS和TUCS-Zn后，黑曲霉菌落的径向生长均比对照组小，其中培养基中加入TUCS-Zn后黑曲霉菌落的径向生长最小，且随着TUCS-Zn浓度的增大，菌丝体直径逐渐减小。数据表明CS、TUCS和TUCS-Zn对黑曲霉生长均有抑制作用，且TUCS-Zn的抑制作用最强。

表2 CS、TUCS和TUCS-Zn(II)对黑曲霉生长的影响Table 2 Effect of CS，TUCS and TUCS-Zn(II)on the growth of A.niger

由表3可以看出，改性后的TUCS和TUCS-Zn对三种被试菌的最小抑菌浓度都比壳聚糖小，进一步说明TUCS-Zn配合物具有更好的抑菌性能。

表3 CS、TUCS 和 TUCS-Zn(II) 对 E.coli、St.aureus和 A.niger的最小抑菌浓度Table 3 MIC of CS、TUCS and TUCS-Zn(II)against E.coli，St.aureus and A.niger

3 结论

利用FT-IR、UV、TG-DTA和XRD手段，对合成的TUCS及TUCS-Zn(II)配合物进行了表征。抑菌实验结果表明，TUCS-Zn配合物对细菌大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌性能比单一的CS、TUCS显著提高，对真菌黑曲霉亦具有较强的抑制作用。

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Preparation，Characterization and Antimicrobial Activity of Thiourea-chitosan-Zn(II)Complex

FENG Xiao-qiang*，LI Xiao-fang，YANG Sheng，ZHANG Jing-feng
College of Life Science and Chemistry，Tianshui Normal University，Tianshui 741001

O627181

A

1001-6880(2012)08-1075-05

2010-07-28 接受日期:2012-06-02

甘肃天水师范学院物理无机化学重点学科基金资助项目(ZD0840)

*通讯作者 Tel:86-015337018100;E-mail:fengxiaoqiang1979@163.com