活性氧介导紫花牡荆素诱导卵巢癌HO-8910细胞调亡

唐 敏 ，夏 红 ，何丽华 ，杨小红 ，谢宛玉

（1.南华大学第一附属医院，湖南 衡阳 421001；2.南华大学肿瘤研究所，湖南 衡阳 4210012；3.湖南师范大学医学院，湖南 长沙 410013）

紫花牡荆素(5,3'-dihydroxy-3,6,7,4'-tetramethoxyflavone,casticin,CAS)是一种具有广泛药理活性的多甲基黄酮类化合物，近年来文献报道CAS对多种肿瘤细胞有抑制增殖和诱导凋亡的作用[1]，引起了人们的广泛关注。在我们的前期实验研究中，已证实CAS具有诱导人卵巢癌HO-8910细胞凋亡作用，且其诱导细胞凋亡可能是通过caspase-3级联而实现的[2]。本研究通过检测CAS处理HO-8910细胞内活性氧生成和细胞膜电位改变，并行抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)干预实验，探讨CAS诱导HO-8910细胞凋亡作用是否涉及活性氧介导的线粒体膜去极化作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

CAS由湖南师范大学药物工程实验室曹建国教授惠赠。人卵巢癌HO-8910细胞株购自中南大学湘雅医学院细胞中心。RPMI-1640（Gibco公司）；新生小牛血清 （杭州四季青）；DMSO （Amresco公司）； NAC、H2DCFH-DA 试剂盒、Rh123（Beyotime）和AnnexinⅤ/PI双染试剂盒购自南京凯基公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基于37℃、5%CO2饱和湿度下培养。细胞贴壁生长于培养基中，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 AnnexinⅤ/PI双染色FCM分析

参照文献[3]方法，取同步化处理24 h的HO-8910细胞，用含不同受试物的10%小牛血清的培养基继续培养，使CAS终浓度为2,4 μg/mL；溶媒对照组终浓度为0.2%DMSO；NAC对照组终浓度为 10 mmol/L NAC；NAC（mmol/L）干预组则取 NAC 10 mmol/L预孵育1 h后再加入CAS终浓度为2，4 μg/mL共孵育48 h。 收集细胞，用冰PBS洗2遍，1000r/m,5min离心，弃上清，按Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒使用说明书步骤进行Annexin V-FITC及碘化丙啶避光染色，半小时内上流式细胞仪检测。以上实验重复3次。

1.2.3 Rh123探针FCM分析

[4]方法，Rh123探针用无血清培养液稀释，使其终浓度为 10 μmol/L，用1.5mL的 EP管分装备用，收集处理后细胞，预冷 PBS洗涤细胞2次，1000r/m,5min离心，弃上清，将细胞重悬于稀释的Rh123溶液中，置细胞培养箱内孵育 （37℃，30min）。取无血清培养液洗涤细胞3次，上机检测，激发波长 488nm，发射波长 525nm。

1.2.4 H2DCFH-DA探针FCM分析

参考文献[5]方法,取无血清培养基将H2DCFH-DA探针按1:1000稀释成终浓度为10 μmol/L溶液，分装于1.5 mL的 EP管中待用。收集处理后各组细胞，取预冷后PBS洗涤 2次，1000rpm×5min离心，弃上清，将细胞悬浮于稀释的DCFH-DA溶液中，37℃细胞培养箱内孵育 30 min，取无血清培养液洗涤细胞 3次，流式细胞仪检，激发波长 488nm，发射波长 525nm。以上实验重复3次。

1.3 统计学处理

实验数据用mean±SD表示，SPSS 13.0软件行统计分析，组间均数比较用One-Way ANOVA分析，以P<0.05为差异有统计学意义标准。

2 结果

2.1 CAS对卵巢癌HO-8910细胞凋亡率的影响

Annexin V/PI双染色FCM分析结果显示CAS(2和4 μg/mL)处理HO-8910细胞48小时的细胞凋亡率分别为 ：9.46±0.95%，14.47±1.47%（P＜0.01），而经NAC(10 mmol/L)预处理后细胞凋亡率下降到 (4.63±0.57%，5.30±0.50%)（P＜0.01）；说明CAS具有诱导HO-8910细胞凋亡作用，并提示该作用至少部分依赖于细胞内活性氧生成(图1)。

2.2 CAS对卵巢癌HO-8910细胞活性氧生成的影响

H2DCFH-DA荧光探针FCM分析结果表明CAS(2和 4 μg/mL)处理 48小时的HO-8910细胞H2DCFH-DA平均荧光强度分别为：36.73±1.52，57.53±2.83；联合 NAC(10 mmol/L)预处理细胞的平均荧光强度分别为：13.63±1.25，14.63±1.60(P<0.05)。说明CAS诱导HO-8910细胞活性氧生成，并证实NAC具有阻断CAS诱导HO-8910细胞活性氧生成作用(图2)。

2.3 CAS对卵巢癌HO-8910细胞膜电位的影响

Rh123探针标记FCM分析细胞内线粒体膜电位结果表明，CAS(2和 4 μg/mL)处理 48h的 HO-8910细胞Rh123平均荧光强度分别为 12.73±1.25、18.20±1.49，明显低于NAC预处理组平均荧光强度 （56.20±2.73，59.7±1.79），及溶媒对照组（84.67±3.73）（P<0.01 ）。 说明 CAS诱导细胞线粒体膜去极化，而抗氧化剂NAC能有效阻止该过程中的线粒体膜去极化作用(图3)。

图2 H2DCFH-DA荧光探针FCM检测HO-8910细胞活性氧生成

图3 Rh123探针标记FCM检测HO-8910细胞线粒体膜电位

3 讨论

卵巢癌是妇科肿瘤中致死率最高的肿瘤，近年来呈上升和年轻化趋势[6]。如何提高卵巢癌的诊治水平，改善治愈率，是函待解决的问题。因此，研发具有选择性诱导癌细胞凋亡，而毒副作用小的卵巢癌治疗药物具有重要的临床意义。

CAS是一种从蔓荆子(Vitex trifolia L)中提取的具有广泛药理活性的多甲氧基黄酮类化合物，近年来研究表明CAS对正常细胞增殖无影响或影响较小，对人白血病、乳腺上皮癌、口腔鳞状细胞癌、人结肠癌、人大肠癌、人肺癌、人纤维肉瘤、前列腺癌、卵巢癌等癌细胞株的增殖具有抑制活性[7]。在我们的前期研究中，论证了CAS对HO-8910细胞的增殖抑制作用以及诱导凋亡效应，并对CAS对抑制人卵巢癌HO-8910细胞增殖和诱导凋亡的效应以及分子生物学机制进行了初步的探讨[2]。

众所周之，细胞产生活性氧的部位是线粒体，其产生的速率与线粒体跨膜电位Δψm的相关。细胞受到外来应激刺激后，在ROS升高的同时，可检测到 Δψm的下降、线粒体膜通透性转换孔的开放、Cyt C的释放，激活线粒体凋亡途径[8]。最近，亦有研究提出CAS抗肿瘤机制可能通过线粒体功能紊乱或是代谢增加使得ROS水平相对升高，细胞谷胱甘肽水平降低，导致肿瘤细胞的氧化应激有关[9]。在本文的研究中，我们再次证实CAS诱导HO-8910细胞凋亡，并呈浓度依赖性。值得注意的是氧自由基清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)有效降低细胞内的ROS水平，NAC预孵育减弱CAS诱导HO-8910细胞凋亡作用。同时用Rh123探针FCM检测线粒体膜电位和H2DCFH-DA探针测定细胞中ROS的生成量，结果显示CAS诱导细胞凋亡过程中存在ROS增高及线粒体膜电位去极化，NAC预孵育能有效阻止该过程中的存在ROS生成及线粒体膜电位去极化，说明CAS诱导细胞凋亡的过程中同时存在ROS升高和线粒体膜电位的降低，并且依赖于ROS的生成。与此前文献报导的CAS抗肿瘤机制可能通过线粒体功能紊乱或是代谢增加使得ROS水平相对升高，导致肿瘤细胞的氧化应激相符合。

总而言之，本文再次验证了前期实验中CAS对人卵巢癌HO-8910细胞凋亡效应，CAS可引起HO-8910细胞内活性氧增加和线粒体膜电位下降，可能涉及氧化应激触发线粒体诱导凋亡途径激活。说明CAS可能是治疗卵巢癌等恶性肿瘤的有效药物，具有开发价值。然而CAS刺激氧化应激的作用机制，还有待于我们进一步研究。

参考文献:

[1]Shen JK,Du HP,Yang M,et al.Casticin induces leukemic cell death through apoptosis and mitotic catastrophe[J].Ann Hematol,2009,88(8):743-52.

[2]白军,谢宛玉,曹建国,等.紫花牡荆素体外抑制人卵巢癌HO-8910细胞增殖和诱导凋亡的研究 [J].现代妇产科进展,2010,(04):265-269.

[3]张景红,冯汗青,李红玉.雄黄微生物提取液诱导K562/ADM细胞凋亡的作用机制研究 [J].中华中医药学刊,2010,(03):533-537.

[4]Cai SB,Zhang X,Chen ZX,et al.Medicated serum prepared with Chinese herbal medicine Zhizhen Recipe down-regulates activity of nuclear factor-kappaB and expression of P-glycoprotein in human colorectal cancer multidrug-resistant cell line HCT-8/VCR[J].Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao,2011,9(12):1353-1359.

[5]Yang XH,Zheng X,Cao JG,et al.8-Bromo-7-methoxychrysin-induced apoptosis of hepatocellular carcinoma cells involves ROS and JNK [J].World J Gastroenterol,2010,16(27):3385-3393.

[6]何健荣,高曦,任泽舫.全球女性乳腺癌和卵巢癌最新发病分布特征[J].中国肿瘤,2009,(03):169-172.

[7]Haidara K,Zamir L,Shi QW,et al.The flavonoid Casticin has multiple mechanisms of tumor cytotoxicity action[J].Cancer Lett,2006,242(2):180-190.

[8]Lass A,Sohal RS.Comparisons of coenzyme Q bound to mitochondrial membrane proteins among different mammalian species[J].Free Radic Biol Med,1999,27(1-2):220-226.

[9]Chen D,Cao J,Tian L,et al.Induction of apoptosis by casticin in cervical cancer cells through reactive oxygen species-mediated mitochondrial signaling pathways[J].Oncol Rep,2011,26(5):1287-1294.