光质对茅膏菜试管苗生长和槲皮素含量的影响

赖瑞联，赖恭梯，张梓浩，林玉玲，赖钟雄

(福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福建 福州 350002)

茅膏菜(Drosera spatuLata)属茅膏菜科茅膏菜属，又称“地上明珠”，叶片上鲜艳的腺毛及腺毛上晶莹剔透的液滴能够捕食昆虫。茅膏菜为传统藏药，其药用成分如矶松素[1－4]和槲皮素[5，6]等在国内外已有广泛研究[7－10]。因此，茅膏菜是集观赏、情趣、药用于一身的稀有植物之一[11]。槲皮素又名栎精、槲皮黄素，属黄酮类化合物，具有多种生物活性和药理作用，能抗氧化、抗自由基、抗癌、抗菌、抗炎和抗过敏[12]。

光照作为影响植物生长最重要的因子之一，在植物代谢产物的合成与积累中起关键作用。本试验以前人研究为基础[12]，通过组织培养的方式，比较茅膏菜试管苗在不同光质(白光、红光、蓝光、绿光)下的生长状况及槲皮素含量，为工厂化生产茅膏菜槲皮素提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 茅膏菜试管苗由福建农林大学园艺植物生物工程研究所提供。

1.1.2 主要试剂 标准槲皮素样品，由中国药品生物制品检定所提供;色谱纯甲醇，购自Merck KGaA 64271 Darmstadt，Germany;其他试剂均为分析纯。

1.1.3 光源 本研究所用的30 W白色、绿色、蓝色、红色荧光灯管均购自佛山照明有限公司。

1.1.4 主要仪器设备 高效液相色谱仪(日立HATACHI L-2000)，检测器(L-2420日立UV-VIS)，工作站(日立HATACHID-2000 ELITE)，离心机(美国贝克曼Allegra 64R)。

1.2 方法

1.2.1 茅膏菜试管苗不同光质培养 茅膏菜试管苗增殖参照赖恭梯等[13]的茅膏菜试管苗叶片不定芽直接发生的方式，以1/2MS+1.0 mg·L－1NAA为培养基[14]，接种无根试管苗，在白光下培养15 d后分别转移到其他培养条件一致的白光、红光、蓝光和绿光下培养。培养基均附加2.0%蔗糖和0.6%琼脂，pH为5.8，每个光照处理接种20瓶，每瓶接种3－4丛茅膏菜试管苗，定期观察其生长情况，并记录。

1.2.2 茅膏菜试管苗采收及处理 将培养约2个月的茅膏菜试管苗从培养瓶中取出，洗净培养基，于75℃烘箱中烘至恒重，分批分别贮藏于自封袋中，常温干燥下保存备用。

1.2.3 槲皮素供试液制备 分别将4个处理的干燥茅膏菜试管苗剪碎，混合均匀，精密称取0.2 g，3次重复，共12个样品。各样品中加入少量石英砂于研钵中研成粉末状，转移到10 mL离心管中，以6 mL甲醇溶解，置70℃水浴中浸提120 min，每20 min轻轻振荡1次，水浴后于28℃，12000 g下离心10 min，上清液转移入新的10 mL离心管中。残渣重新加入3 mL甲醇，置70℃水浴中重复提取1次，时间为80 min，同上条件进行离心，合并上清液，并定容为10 mL，做好12个样品的标记。

1.2.4 槲皮素标准对照液制备 精密称取10 mg槲皮素，以甲醇溶解并定容至10 mL，得1.0 mg·mL－1槲皮素标准贮备液。用移液枪吸取贮备液1 mL于50 mL容量瓶中，用甲醇定容，即得0.02 mg·mL－1对照液，于4℃冰箱中贮藏备用。

1.2.5 槲皮素含量测定 槲皮素含量采用高效液相色谱法(HPLC)测定。色谱条件[15]:Luna C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流动相:甲醇 －0.4%磷酸溶液(63∶37);流速:1.0 mL· min－1;柱温:30 ℃;检测波长:280 nm;进样体积:10 μL。

1.2.6 数据分析与计算方式 槲皮素/(mg·g－1)=(C0×V)/m。式中，C0为供试液浓度/(mg·mL－1)，V为供试液总体积(V=10 mL)，m为茅膏菜样品质量(m=0.2 g)。

数据采用Excel和DPS软件分析。

2 结果与分析

2.1 光质对茅膏菜试管苗生长的影响

本试验比较了4种光质对茅膏菜试管苗生长状况的影响。在进行光照对比处理前，接种后的茅膏菜试管苗先于白光(常规光照)下培养15 d，以确保处理前的茅膏菜生长一致且正常，之后转移到不同光质下培养45 d左右。

在生根培养基上，4种光质下的茅膏菜试管苗生根率都达到100%，根浓黑、粗长，根毛发达。不同光质处理下试管苗生长状况见表1及图1。白光和红光处理的茅膏菜试管苗植株较矮，白光处理的植株呈莲座状，观赏性高，而红光处理则表现为皱缩状，蓝光和绿光处理的植株较高且挺拔。不同光质处理下茅膏菜叶片的生长也存在很大差异，白光和红光处理叶片颜色浓绿、较短，但是白光处理叶片较粗，蓝光和绿光处理叶片较长，趋于竖直生长，蓝光下叶色稍浅。茅膏菜叶片上的腺毛生长也受光质的影响，白光和红光处理腺毛粗长、鲜红并挂有液滴，蓝光处理腺毛长度次之，绿光处理最短，蓝、绿光处理的腺毛绿色带红，基本没有分泌粘液。综上所述，光质对茅膏菜生长影响的强弱依次为:白光＞红光＞蓝光＞绿光。

表1 光质对茅膏菜试管苗生长的影响Table1 Effects of different light qualities on growth of in vitro plantlets in sundew

图1 不同光质下茅膏菜试管苗的生长状况(接种2个月后)Fig.1 Effects of different light qualities on growth of in vitro plantlets(2 months)in sundew

培养4个月后，茅膏菜试管苗生长状况见图2，培养瓶中茅膏菜试管苗密度加大，蓝光和绿光下植株密度大于白光和红光，且茅膏菜试管苗不同光质之间的差异程度较培养2个月的试管苗明显加大，白光下试管苗生长健壮，叶片平展，浓绿，腺毛发达，红光下随着培养时间的延长，皱缩或团状生长明显加强，而蓝光和绿光下，试管苗生长较弱，腺毛逐渐退化，蓝光下试管苗叶色偏黄，绿光下试管苗上端快速伸长且白化。可见，不同光质对茅膏菜试管苗生长影响极大。

2.2 光质对茅膏菜试管苗槲皮素含量的影响

采用HPLC的方法测定茅膏菜试管苗槲皮素含量，槲皮素标样和茅膏菜样品的HPLC图谱见图3、4。4 种光质处理后茅膏菜试管苗槲皮素含量依次升高(图5)，分别为 0.444、0.465、0.473、0.726 mg·g－1，方差齐性检验采用卡方检验方法，P为0.1216(＞P0.05)，表明各处理的方差不存在显著的异质性，故可进行方差分析。进一步表明，前3者的处理结果没有显著性差异，而绿光处理达到极显著水平。

本试验表明，白光最有利于茅膏菜形态建成，红光次之，蓝光、绿光则不利于茅膏菜试管苗的正常生长;相反，白光和红光对茅膏菜试管苗槲皮素含量的积累效应最差，而蓝光，尤其是绿光对槲皮素的积累具有促进作用。

3 讨论

3.1 不同光质对茅膏菜试管苗形态建成影响的比较

本研究表明，白光和长波光比短波光更能促进茅膏菜试管苗形态建成。白光对植物生长有较显著的促进作用，能提供生长发育所需要的各种波长的光源，因此，一般认为其是植物正常生长发育的最佳光照;长波光(如红光)在植物生长中具有积极的促进效果，红光下茅膏菜试管苗生长状态明显优于蓝光和绿光，这与刘媛等[16]、倪德祥等[17]、张瑞华等[18]、李胜等[19]、赵德修等[20]、Kim et al[21]研究结果基本一致。不同光质对茅膏菜试管苗光形态建成的影响可能是多方面因素共同作用的结果。Parks et al[22]认为红光可提高植物光敏色素A的表达，从而提高光合速率;而史宏志等[23]发现红光具有促进碳氮代谢协调的作用，而蓝光等短波光下，植物的呼吸速率增强，净光合作用下降;在分子水平上，张蕾[24]则认为红光可能促进植物细胞伸长，而蓝光可能抑制细胞伸长。总之，长波光有利于植物干物质积累，促进植物生长，而短波光具有相反的效果[25，26]。此外，不同光质处理造成的茅膏菜试管苗呈现不同生长状态也可能与不同光质影响植株内生长素(IAA)氧化酶的活性有关，在一定程度上短波光作用下茅膏菜IAA氧化酶活性增强，IAA的含量减少，植株生长受抑制。

童哲[27]认为光形态建成过程中不仅光质有调节作用，而且光质的纯度也在一定程度上对植物产生影响。目前，在研究光质对植物生长的影响方面，虽然有较大的进展，但光质纯度的研究仍然很薄弱，不同种类植物、不同发育年龄和状态、不同组织或器官对同种光质的反应也不相同，光质的生物学反应极其复杂，其对植物生长的影响及分子机制研究依然任重而道远。

图5 不同光质处理对茅膏菜试管苗槲皮素含量的影响Fig.5 Effects of different light qualities on contents of quercetin of in vitro plantlets in sundew

3.2 短波光促进茅膏菜试管苗槲皮素的积累

本研究表明，短波光(如绿光、蓝光)对茅膏菜试管苗槲皮素的积累起重要作用。冷平生等[28]研究光质对银杏黄酮苷含量合成的影响发现，绿光下槲皮素的百分含量最高，而红光最低;赵德修等[20]认为蓝光对水母莲愈伤组织的生长无明显影响，但是显著提高黄酮的含量，其次是白光和红光;谢宝东等[29]也发现蓝光、绿光等短波光对银杏叶片黄酮含量有促进作用;此外，李艳等[30]、赵淼等[31]、王丽娟等[32]、苏文华等[33]也得出了相似的研究结果，徐茂军等[34]认为蓝光促进异黄酮积累，而红光起了抑制作用。这种结果的形成可能由于蓝光和绿光等短波光促进了黄酮类物质合成的酶蛋白基因的表达，从而使与黄酮类物质合成相关的酶的活性和含量大大提高[35]。在黄酮类物质代谢途径中发挥了重要作用，但具体光质如何影响相关酶类的合成目前尚不清楚。

短波光对植物中槲皮素等黄酮类物质的积累具有促进作用。依靠组织培养的手段，可以有效快速获取大量药用植物原材料，并结合适当光质处理，可以为药用成分开发奠定基础。然而由于光质对植物次生代谢物积累的影响研究较少，影响机理尚不明确，有待不断深入探索。

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