篦齿蒿提取物的抗菌试验

裴大为，王纯洁，敖日格乐

（内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特010018）

篦齿蒿（Neopallasia pectinata）即为栉叶蒿，为一年生草本菊科植物栉叶蒿的地上部分。其味苦性寒，具有清利肝胆、消炎、抗菌、抗病毒和止痛作用。其化学成分主要为植物甾醇和倍半萜类及其衍生物，其抗菌作用与所含的β－谷甾醇和倍半萜类及其衍生物有关［1－2］。本试验测定了篦齿蒿的几种提取物对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌和链球菌的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC），以检验篦齿蒿提取物的体外抑菌效果。测定了篦齿蒿的几种提取物对金黄色葡萄球菌和链球菌感染小鼠的保护率，检验体内抗菌效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 篦齿蒿，从内蒙古锡林郭勒盟草原采摘，阴干，粉碎，过40目筛。

1.1.2 实验动物 纯昆明种小鼠，体重20 g±2 g，雌雄兼用，购自内蒙古大学实验动物中心，许可证号SCXK（蒙2002－0001）。

1.1.3 菌株 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、链球菌由课题组从呼和浩特地区奶牛场乳房炎患牛奶中分离并鉴定［3］，沙门菌由内蒙古农业大学兽医学院微生物实验室提供。

1.1.4 试剂 普通琼脂、营养肉汤：广东环凯微生物科技有限公司，批号：20100622，均按常规方法配置。

1.2 方法

1.2.1 药物的提取

1.2.1.1 篦齿蒿水提取物的制备 50 g粉碎后的篦齿蒿，加入200 mL蒸馏水浸泡1 h，煎煮15 min，过滤；残渣再加入100 mL蒸馏水，煮沸后10 min，过滤，合并提取液，浓缩至50 mL，使浓度达到1 g／mL。高压灭菌，4℃保存备用。

1.2.1.2 篦齿蒿醇提取物的制备 200 g粉碎后的篦齿蒿置于2 000 mL的烧瓶中，加入950 mL／L的乙醇800 mL，加热回流提取，分别提取3次，每次1.5 h，过滤合并提取液，减压浓缩成浸膏放入无菌瓶中4℃保存备用［4］。将制备好的乙醇浸膏散于少量水中，以石油醚（1∶1）萃取3次，得石油醚萃取物；以同样方法比例依次得到乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物组和最后留下的水母液［5－6］。减压浓缩干燥，入无菌瓶中放置于4℃冰箱备用。

1.2.2 菌液制备 将经过培养的单个菌落接种于营养肉汤中，于生化培养箱中37℃培养18 h～24 h，用生理盐水10倍系列稀释，将与标准化浊度相当的作为试验用菌悬液，存于4℃冰箱备用［7］。

1.2.3 抗菌试验

1.2.3.1 药物的抑菌圈直径的测定 采用牛津杯法，在无菌条件下，将0.5 mL菌液加入到普通营养琼脂中，用玻璃涂布棒涂匀，为菌层。将牛津杯放入培养基中，分别加入1 g／mL的篦齿蒿水提物和醇提取物的萃取物各100μL，37℃培养24 h（链球菌48 h），测量其抑菌圈直径，极度敏感为直径大于15 mm，在10 mm～15 mm之间为高度敏感，8 mm～10 mm 为敏感，8 mm 以下为不敏感［8－9］。

1.2.3.2 药物的最低抑菌浓度（MIC）及最低杀菌浓度（MBC）的测定 采用二倍稀释法测定篦齿蒿水提物和萃取物组对4种菌的MIC。将5种药液浓度分别配制成 1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 g／mL，在上述试管中分别加入已制备好的菌液50μL，混匀，37℃培养24 h（链球菌48 h），以观察未见细菌生长的药物浓度为该药液的MIC［10－11］；从未见细菌生长的试管中分别吸取50μL培养物接种于普通营养琼脂平板上，37℃培养24 h（链球菌48 h），菌落数小于5个即为此药液的MBC［12－13］。

1.2.3.3 体内抑菌试验 将试验小鼠随机分为14组，每组10只，分为两批阴性对照组、阳性对照组、水提取物组、石油醚提取物组、乙酸乙酯提取物组和正丁醇提取物组，水母液组。阴性对照组灌服无菌水20 g／kg；阳性对照组灌服9 g／L环丙沙星药液0.1g／kg；其他组灌服对应药液2 g／kg。各组小鼠每天灌药2次，灌服7 d。末次给药1 h后分为两大组，金黄色葡萄球菌和链球菌组，给各组小鼠腹腔注射80%最低致死量（MLD）的对应致病菌。观察感染后3 d内各组小鼠的死亡情况，保护率计算方法为：（阴性对照组小鼠死亡数－处理组死亡数）／阴性对照组小鼠死亡数×100%［14－15］。

2 结果

2.1 药物抑菌圈直径的测定结果

由表1可知，篦齿蒿的乙酸乙酯萃取物对沙门菌、链球菌敏感，对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌高度敏感，正丁醇萃取物对金黄色葡萄球菌和链球菌高度敏感，水母液对金黄色葡萄球菌和链球菌敏感；水提取物仅对金黄色葡萄球菌极度敏感，石油醚萃取物不敏感。

表1 篦齿蒿5种提取物对4种细菌的抑菌效果Table1 The bacteriostasis diameter of the Neopallasia pectinata extracts

2.2 药物的MIC和MBC测定结果

由表2可知，篦齿蒿乙酸乙酯萃取物对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的MIC和MBC分别达到0.062 5、0.062 5和0.125、0.125 g／mL，有显著抑菌效果，对沙门菌、链球菌次之。正丁醇萃取物和水母液对金黄色葡萄球菌和链球菌有显著抑菌效果；石油醚萃取物对金黄色葡萄球菌有显著效果，对大肠埃希菌次之；水提取物只对金黄色葡萄球菌有显著效果，其 MIC和 MBC分别达到0.031 25和0.062 5 g／mL。

表2 篦齿蒿5种提取物对4种细菌的MIC和MBCTable2 MIC and MBC of the Neopallasia pectinata extracts in vitrog／mL

2.3 体内抑菌试验结果

由表3可知，篦齿蒿提取物对链球菌引起的病变疗效较差，试验组小鼠死亡保护率均高于阴性对照组，其中篦齿蒿乙酸乙酯提取物对金黄色葡萄球菌感染小鼠的保护率为75%，与阳性对照组相当。

表3 篦齿蒿5种提取物对2种细菌感染小鼠的保护率Table3 The protection rate of Neopallasia pectinata extracts in mice infected with Staphyloccocus aureus and Streptococcus

3 讨论

从试验数据可以看出，篦齿蒿的各种提取成分对4种常见致病菌均有一定程度的抑菌效果，尤其对金黄色葡萄球菌作用明显，5种不同提取物对金黄色葡萄球菌的MIC都在0.0625 g／mL或以上。乙酸乙酯萃取物对4种菌的MIC大于或等于0.125 g／mL，正丁醇萃取物对金黄色葡萄球菌和链球菌的MIC和 MBC分别达到0.031 25、0.062 5 g／mL和0.062 5、0.125 g／mL，抑菌效果显著，表明乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物是体外抗菌的主要活性部分，水母液和石油醚萃取物略有抑菌作用。篦齿蒿提取物的体内抗菌试验表明，对金黄色葡萄球菌引起的病变较敏感，篦齿蒿体内活性成分主要集中在乙酸乙酯提取物中，其他成分活性小。

试验表明篦齿蒿提取物的体内抗菌效果与体外抑菌效果并不一致，药物在体内、体外对致病菌的疗效不同可能与药物在体内的代谢或者药物进入体内后可能参与或增强机体免疫力，增加或改变对致病菌的作用方式有关，具体机理有待进一步研究。

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