呕吐毒素单克隆抗体制备及鉴定

孙 震，冯才伟，李 勇，吴 鹏，冯 静，韩京朋

（北京勤邦生物技术有限公司，北京102206）

呕吐毒素（vomitoxin），又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），化学名称为3α，7α，1，5－三羟基草镰孢菌－9－烯－8－酮，属单端孢霉烯族化合物［1－2］。单端孢霉烯族毒素共有150多种，是一类强有力免疫抑制剂，所引起典型症状是采食量降低，所以这类毒素又叫饲料拒食毒素，DON是其中最重要一种毒素［3－4］。

DON主要来自镰刀菌属（Fusarium），尤其是禾谷镰刀菌（Fusarium grarninearum）和黄色镰刀菌（Fusarium culmorum），其结构为四环倍半萜，分子式为 C15H20O6，分子质量296.3 ku［5－6］。其结构式如下（图1）：

图1 DON化学结构式Fig.1 DON chemical structure

由于DON具有很高的细胞毒性及免疫抑制性，因此，对人类及动物的健康构成了威胁。1998年，在国际癌症研究机构公布的评价报告中，呕吐毒素被列为3类致癌物［7］。国际上对呕吐毒素的检测方法研究进展较快。先后出现了薄层色谱法和高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）、酶联免疫（ELISA）的检测方法［8］。目前国内用于DON检测的ELISA试剂盒很少，而实现商品化的更少。本研究期望通过研究制备出抗DON的高效价、高特异性单克隆抗体，并最终开发出可用于食品中DON检测的酶联免疫检测产品。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 DON为上海安普科学仪器有限公司产品，牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）为Sigma公司产品；3，3′，5，5′－四甲基联苯胺（TMB）、戊二醛、马来酸酐、4－二甲氨基吡啶（DMAP）1－乙基－（3－二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）、二甲基甲酰胺（DMF）为国药集团化学试剂有限公司产品；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗为美国Jackson公司产品；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂为北京勤邦生物技术有限公司产品，细胞培养基RPMI－1640为Hyclone公司产品，其他有关化学试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器 Uitrospec紫外－可见光分光光度计为Amersham公司产品，磁力搅拌器90－2为上海振荣科学仪器有限公司产品；低速离心机Anke TDL－40B为上海安亭科学仪器有限公司产品；酶标仪MK3为美国Thermo公司产品；凝胶成像系统及分析软件为Syngene公司产品；JM－250电泳仪为大连捷麦科贸公司产品；生化培养箱DHP－600为天津市中环实验电炉有限公司产品；电子天平、微量移液器等。

1.2 方法

1.2.1 半抗原合成 取20 mg DON、1 mol马来酸酐、催化量的DMAP，溶于2 mL甲苯中，于80℃搅拌反应，8 h～20 h后，蒸干溶剂，酸化，萃取，重结晶后得到DON半抗原，其合成公式见图2。

图2 半抗原合成路线Fig.2 DON hapten synthetic route

1.2.2 DON抗原合成 将DON半抗原与BSA偶联得到免疫原。具体操作如下：取60 mg BSA溶于9.5 mL 0.01 mol／L，p H5.0的 PBS溶液中，加入12.5 mg EDC，再加入1 mL DMF 溶解的10 mg DON半抗原，室温搅拌反应1 h，再加6 mg EDC，置于阴暗处搅拌反应并过夜，用0.01 mol／L PBS透析3 d，每天更换透析液3次，得到DON－BSA，即为免疫原。将DON半抗原与OVA偶联得到包被原。反应步骤同免疫原制备，所用OVA量为45 mg。

1.2.3 偶联抗原的鉴定

1.2.3.1 紫外分光光度计鉴定 将偶联抗原进行20倍稀释后，分别在波长260 nm、280 nm处测定紫外吸光度，根据公式（1）计算结合抗原蛋白质浓度［9］。

利用紫外－可见光分光光度计对DON、载体蛋白、偶联抗原进行扫描，在最大吸收波长λmax下测定其吸光值，根据公式（2）分别计算DON、载体蛋白、偶联抗原的摩尔吸光系数。

式中：A是各物质在最大波长处的吸光度，C是各物质的浓度，L是比色杯的直径。根据计算所得摩尔吸光系数（ε），按公式（3）计算偶联抗原的结合比。

1.2.3.2 SDS－PAGE对偶联抗原纯度鉴定 将BSA、OVA 和偶联产物DON－BSA、DON－OVA 用PBS（0.01 mol／L、p H7.4）适当稀释后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。浓缩胶为50 g／L，分离胶为120 g／L，浓缩胶电压为80 V，分离胶电压为160 V，上样量为10μL，考马斯亮蓝染色5 h～6 h后，置脱色液中脱色过夜。

1.2.4 Mc Ab制备

1.2.4.1 动物免疫 将合成的免疫原 DON－BSA与弗氏佐剂按1∶1的比例混合乳化，对6周龄～8周龄Balb／c小鼠进行免疫，颈背部皮下多点注射，免疫剂量为150μg／只，分别在14 d和28 d进行二免和三免，采用弗氏不完全佐剂，免疫剂量同上，31 d后加强免疫，直接采用免疫原免疫，免疫剂量为100μg／只，最后1次免疫后7 d断尾采血分离血清，3 000 r／min离心5 min，收集血清备用。

1.2.4.2 融合细胞备用小鼠选择 先用方阵滴定法确定检测抗原最佳包被质量浓度，然后用间接ELISA测定所采集的小鼠血清抗体效价，以待测孔OD450值≥NC OD450值的2.1倍（P／N≥2.1）判为阳性，选取效价高的小鼠作为脾细胞提供鼠，具体方法同邓舜洲的方法［10］。

1.2.4.3 细胞的融合、筛选、克隆化及腹水制备 细胞融合前3 d，对融合小鼠采用DON－BSA 50μg／只（不含弗氏佐剂）腹腔注射式超免。取小鼠脾细胞与Sp2／0细胞进行融合，用间接ELISA法进行筛选，所用的包被抗原是5μg／mL OVA－DON检测抗原，分别加入被测孔的培养上清，以P／N＞2.1为判断依据，筛选阳性孔，选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔采用有限稀释法进行亚克隆，亚克隆化3次后所有孔的克隆都为阳性，最终得到分泌DON－McAb的杂交瘤细胞株，最后选择OD值高、细胞活力好的单克隆细胞进行扩大培养、冻存、鉴定和建株。按常规法制备腹水。

1.2.5 间接竞争ELSIA建立标准曲线 取DONOVA 以0.01 mol／L p H7.4的PBS作1∶3 000稀释，按照每孔100μL进行包被，37℃温育2 h，倾去包被液，用PBST洗涤2次，每孔中加入200μL封闭液，37℃温育2 h，倾去孔内液体，备用。向酶标板微孔中加入质量浓度分别为0、0.5、1.5、4.5、13.5、40.5μg／L的系列DON标准品50μL／孔，随即加入0.01 mol／L p H7.4的PBS以1∶3 000稀释羊抗鼠酶标二抗50 μL／孔，再加入0.01 mol／L p H7.4 PBS以1∶36 000稀释的 DON－McAb 50μL／孔，25℃反应30 min，用PBST洗涤3次，拍干，加入显色底物，25℃反应15 min，加入2 mol／L的硫酸终止反应，用酶标仪以450 nm／630 nm双波长读取OD值。

以酶联免疫方法测定DON各浓度的标准品溶液的吸光度值（B），以吸光度值（B）除以零标准品吸光度值（B0）再乘以100%，得到百分吸光度值，以DON标准品浓度（μg／L）的对数值（log10C）为X轴（为方便数据分析，应用软件分析时，通常将对数值用对应的标准品浓度值进行替换），百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线。

1.2.6 Mc Ab鉴定

1.2.6.1 克隆抗体亚型鉴定 纯化McAb用单克隆抗体Ig类／亚类鉴定试剂盒进行抗体免疫球蛋白亚型鉴定。

1.2.6.2 McAb的分子质量测定 腹水纯化后，进行SDS－PAGE。对电泳结果进行凝胶成像分析，根据抗体重链和轻链在凝胶中迁移情况以及IgG中重链和轻链的比例关系，估算出抗体分子的分子质量。

1.2.6.3 敏感性的测定 根据间接竞争ELISA方法所绘制的标准曲线，计算DON－Mc Ab对DON的IC50值。

1.2.6.4 交叉反应率测定 选取2种其他霉菌毒素测定交叉反应率，通过各毒素的标准曲线分别得到其IC50。按下式分别计算Mc Ab对其它霉菌毒素的交叉反应率：

2 结果

2.1 偶联产物的分析

2.1.1 偶联抗原浓度的测定 偶联抗原透析后，将透析袋中的液体定量。取出少量，经稀释后，分别在波长260 nm、280 nm处测定紫外吸光度，计算偶联抗原的浓度。计算结果BSA－DON的浓度为5.6 mg／mL，OVA－DON的浓度为4.1 mg／mL。

2.1.2 紫外分光光度法计算偶联抗原的分子结合比

用紫外分光光度计分别绘制DON、BSA、BSADON和DON、OVA、OVA－DON的紫外扫描图（图3、图4）。偶联抗原特征峰发生位移，表明偶联成功。比色杯的直径（L）相同，根据各物质在最大波长处的吸光度（A）和各物质的浓度（C），按照1.2.3.1所述公式计算得出偶联抗原的分子结合比，BSA与DON的分子结合比为1∶18.4，OVA与DON的分子结合比为1∶12.8。

图3 DON－BSA、BSA、DON紫外扫描图谱Fig.3 UV spectra of DON－BSA，BSA and DON

图4 DON－OVA、OVA、DON紫外扫描图谱Fig.4 UV spectra of DON－OVA，OVA，and DON

2.1.3 SDS－PAGE 对偶联抗原分析 将 BSA、OVA分别与制备的偶联产物BSA－DON、OVADON进行凝胶电泳分析，从电泳图（图5）中可以看出，因DON分子质量很小，偶联前后对载体蛋白分子质量改变程度不大，所以偶联前后蛋白质的条带位置变化较小。条带的位置变化，初步证明了偶联是成功的。

2.2 Mc Ab鉴定

2.2.1 Mc Ab工作浓度测定 采用方正滴定法确定最佳抗原包被质量浓度与抗体工作浓度，结果见表1。对于酶标仪，OD值在1～2之间时读数的可信度较大，所以一般取OD值在1.5～2.0之间的孔所对应的包被浓度为最佳包被浓度；另外为了后期免疫检测产品的灵敏度和准确度考虑，一般控制抑制率在70%～80%之间，从表1中可知，抗原包被质量浓度为1.0μg／mL，Mc Ab工作浓度为1∶2.4×104时OD值和抑制率均符合要求。

2.2.2 Mc Ab亚型鉴定 用Ig亚类鉴定试剂盒（Ig－Gl、Ig G2a、IgG2b、Ig M、Ig A）经间接 ELISA 方法检测，结果表明所得Mc Ab均为IgGl。

2.2.3 腹水抗体分子质量测定 对所得腹水Mc Ab纯化后，进行变性SDS－PAGE（图6）。对电泳结果进行凝胶成像分析，根据抗体重链和轻链在凝胶中迁移情况以及IgG中重链和轻链的比例关系，估算出了抗体分子的分子质量为158 ku。

表1 抗原包被浓度和抗体稀释浓度的测定结果Table1 Result of antigen coating and antibody dilution concentration

图6 Mc Ab电泳图谱Fig.6 SDS－PAGE spectrum of monoclonal antibody

2.2.4 敏感性鉴定结果 根据建立的间接竞争ELSIA方法得到的DON标准曲线如图7所示，标准抑制曲线的线性回归方程为y＝37.267x＋61.765，标准曲线IC50为1.7μg／L，该试验所获Mc Ab对DON具有较高的敏感性。

2.2.5 Mc Ab特异性 交叉反应率结果见表2。由表2可知，本试验制备的抗DON的Mc Ab与DON的交叉反应率很高，而与T2、黄曲霉毒素B1几乎没有交叉反应，故筛选到的单抗对DON具有很强的特异性。

图7 DON标准曲线Fig.7 Calibration curve of DON

表2 交叉反应率检测结果Table2 Results of cross－reactivity

3 讨论

DON为小分子物质（分子质量296.3 u），没有免疫原性，是不完全抗原，不能诱导动物机体产生抗体。必须与大分子载体蛋白偶联后成为完全抗原才具有免疫原性可制备成免疫抗原［11－12］。而DON分子本身没有可与载体蛋白结合的可供活化的功能基团，因此无法直接制备DON偶联抗原［15］。马来酸酐分子中有两个羰基C＝O和两个双键C＝C共轭，因而具有活泼的化学性质，能进行聚合反应、异构化、加成、自由基反应、狄尔斯－阿尔德反应、酯化反应等［14］。因马来酸酐分子中含有羧基，可与蛋白质的氨基结合，因而可以形成蛋白质与小分子的偶联物。

本研究通过化学法合成羧基化的DON，分别与BSA、OVA偶联作为免疫抗原和检测抗原。因为BSA与OVA之间没有交叉抗原，所以可以用DON－BSA作为免疫抗原免疫小鼠，用DON－OVA包被酶标板，检测DON抗体的效价。

小鼠腹水中含有大量的内含物，为消除这些内含物的干扰，需对腹水进行纯化。腹水的纯化应根据单抗的种属、免疫球蛋白的类型、抗体纯度等选择最佳的纯化方法，同时还要考虑在纯化的过程中保持抗体的活性、纯度和得率等。本研究所得Mc Ab为IgG1亚型，所以可选用适用于IgGl抗体纯化的辛酸－硫酸铵法对所得的腹水进行纯化［15］。

本研究所得Mc Ab分子质量为158 ku，所制备的Mc Ab对DON具有很高的敏感性（IC50＝1.7 μg／L），并且抑制标准曲线在0.5μg／L～40.5μg／L之间线性关系良好，与T2、黄曲霉毒素B1几乎没有交叉反应，完全能够满足对于DON残留检测要求，筛选到的Mc Ab可用于进一步研制DON酶联免疫检测产品。

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