柑橘溃疡病土壤拮抗菌的筛选、鉴定及防效测定

董玉兰，唐前君，易图永，肖启明

（湖南农业大学生物安全科技学院，湖南 长沙 410128）

柑橘溃疡病是一种细菌性植物病害，因导致植株枝叶及果实产生溃疡性病斑而得名，公认为世界性的检疫病害，对农业生产造成巨大损失[1]。近年来，柑橘溃疡病的防治已经由最初的化学防治转向更具优势的生物防治[2]。生物防治的优势在于其防治剂只对有害病菌起作用，不仅可避免化学药物对农产品的污染，而且可保护生态环境免遭破坏[3]。而拮抗微生物的利用又是生物防治措施中的研究重点。有报道称可从柑橘叶片、果实及柑橘园土壤中分离出有拮抗作用的菌株[4-5]，因此笔者采集了湖南不同地区的土壤，拟从中分离纯化出对柑橘溃疡病菌有拮抗作用的微生物，再通过筛选及室内防效测试，选取防效最好的菌株，为制备柑橘溃疡病生物防治剂做准备。

1 材料与方法

1.1 试验材料

通过5 点取样法分别于慈利、郴州、永州、长沙等地的水稻、烟草、柑橘产区采集了16 个土壤样品；供试病原菌和供试柑橘苗（脐橙）由国家柑橘改良中心长沙分中心提供；供试培养基有牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基（放线菌）、PDA 培养基（真菌）。

1.2 试验方法

1.2.1 拮抗菌分离与纯化 取各种土样10 g，放入装有90 mL 无菌水（有玻璃珠）的三角瓶中，震荡1 h；将菌悬液依次稀释；细菌采用混匀法，真菌和放线菌采用涂沫法进行分离纯化[6-7]。从采集到的16个土样中，共分离出细菌167 株，放线菌92 株，真菌88 株，总计347 株，用于拮抗试验。

1.2.2 拮抗菌株筛选 采用平板对峙法进行初筛，选择初筛试验中有拮抗效果的菌株进行牛津杯法复筛[8-9]。

1.2.3 拮抗菌形态学观察 采用基础培养基表面划线的方法，观察菌落形态；用大肠杆菌和葡萄球菌分别作阴性和阳性对照，对拮抗效果最好的菌株做镜检，观察其显微结构。鉴定标准参照《常见细菌系统鉴定手册》[10]进行。

1.2.4 拮抗菌室内防效试验 选取复筛试验中拮抗效果明显的菌株进行活体防效试验。供试拮抗菌和供试柑橘溃疡病菌分别制备成浓度约为1×108cfu/mL 的菌悬液，采用双面喷施的方法做4 组处理：A 先喷施拮抗菌菌悬液（AM），2 d 后喷施柑橘溃疡病病原菌菌悬液（PC）；B 同时喷施AM 和PC；C 先喷施PC，2 d 后喷施AM；D 同时喷施PC 和清水做对照，每个处理3 次重复，每个重复20 个叶片，接种后，保湿10 d，控制环境温度在28℃左右，每隔一个星期观察一次发病情况。抗溃疡病分级标准参照《农药田间药效试验准则》[11]进行。

发病率、病情指数和相对防效的计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 拮抗菌筛选

平板对峙初筛后得到有拮抗作用的细菌21株，放线菌6 株，真菌4 株。牛津杯法复筛后得到3个拮抗效果最好的菌株CZR1、CLH2、CLT3，分别来自郴州仁义镇水稻土、张家界慈利乡柑橘园土和张家界慈利乡柑橘园土。从图1 可知：CZR1 号菌株的抑菌圈直径的平均值在43 mm 左右，抑菌圈边缘模糊；CLH2 菌株的抑菌圈直径的平均值在55 mm左右，抑菌圈边缘略微隆起；CLT3 的抑菌圈直径的平均值在45 mm 左右，抑菌圈边缘清晰。

图1 3 株拮抗菌的抑菌效果

2.2 拮抗菌形态学

从图2 可看出，CZR1 的菌落小而密集，圆滑不透明，不产色素；CLH2 的单菌落表面圆滑且体积大，直径可达5 mm 左右，不透明，菌体产绿色素，培养基呈绿色；CLT3 的单菌落大小较为均匀，质地紧密不易挑起，干燥多皱的表面产生一层白色绒毛状的菌丝，与放线菌的菌落形态相似，其培养基的颜色因菌体产黑色素而发黑。

图2 3 株拮抗菌菌落形态

通过革兰氏染色、芽孢染色、鞭毛染色及荚膜染色法对三株拮抗效果显著的菌株光学显微观察，其特征如下：CLT3 ，革兰氏染色阳性，无芽孢，无鞭毛，也无荚膜；CLH2，革兰氏染色阴性，无芽孢，有单鞭毛和荚膜；CZR1，革兰氏染色阴性，有芽孢和荚膜，无鞭毛。

显微结构显示：CLT3 呈分枝丝状，气生菌丝白色，基内菌丝深灰色，孢子卵圆形，具典型的放线菌特征；CLH2 为两端钝圆的杆状，有的排成线状，有的排成短链状；CZR1 为棒状，同CLH2 一样表现出细菌的特征。

表1 3 株拮抗菌生理生化反应

2.3 拮抗菌生理生化反应

3 株拮抗菌的生理生化测定结果显示（表1），3株菌株在氧化酶、接触酶、葡萄糖氧化发酵等多项生化测试中呈现明显差异。在15 项检测中，CLT3与CLH2 有8 项结果相同，与CZR1 有10 项结果相同，而CLH2 和CZR1 的测试结果有11 项相同，CLH2 和CZR1 的亲缘关系较之CLT3 和CZR1、CLT3 和CLH2 较为亲近。根据生理生化测定结果和《常见细菌系统鉴定手册》初步判断，CLT3 为链霉菌属，CLH2 为假单胞菌属，CZR1 为伯克氏菌属。

2.4 拮抗菌温室防效

不同处理方式的防效结果显示（表2），B 处理的发病率与病情指数明显低于A 和C 处理，防效较之A、C 更为明显。综合三株拮抗菌看，CLT3 的防效最为突出，尤其是B 处理防效达到83.85%。统计分析结果表明，试验组的柑橘溃疡病的发病率和病情指数均比对照组低，三株拮抗菌的防效基本都在50%以上。这说明在温室环境下（28～30℃，湿度40%），以上三株拮抗菌皆表现出较好的防效。

表2 3 株拮抗菌温室防治效果

3 结 论

试验从水稻田区，烟草轮作区，荒废的柑橘园区及无病的园区采集了16 种土壤样品，分离纯化出31 株拮抗菌株，占总菌数的8.93%。其中，来自无病柑橘园区的菌株占所有拮抗菌总数的74.19%，可见无病的柑橘园区是分离柑橘溃疡病菌的主要来源。杯碟法试验结果显示，31 株拮抗菌株中CZR1、CLH2 和CLT3 三株菌株的抑菌活性最强，对供试柑橘溃疡病菌的抑菌圈直径均大于40 mm。室内防效以CLT3 菌株的拮抗效果最突出，相对防效可达83.85%。

经形态学研究，CLT3 与放线菌的形态特征相似，CZR1 和CLH2 两株菌株的形态特征与细菌的较为相符；采用传统的生理生化测定结合形态特征观察，对三株拮抗菌进行了初步分类，结果表明CLT3 为链霉菌属，CLH2 为假单胞菌属，CZR1 为伯克氏菌属。

该研究结果说明，从土壤中可以筛选出对柑橘溃疡病有明显拮抗作用的菌株，丰富了拮抗菌资源库。三株菌株所属的具体种属、分子生物学特性、杀菌作用机理，以及在自然环境中的田间防效有待进一步研究。

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