超声波辅助提取桦褐孔菌多糖的工艺研究

张丽霞，李凌智

(大庆师范学院 生命科学学院，黑龙江 大庆 163712)

0 引言

桦褐孔菌(Inonotus obliquus)属于真菌门，担子菌亚门，层菌纲，非褐菌目，多孔菌科，褐卧孔菌属[1]，主要生长在俄罗斯北部，中国的黑龙江、吉林和日本北海道等寒冷地区[2]。多糖是桦褐孔菌重要的活性成分，具有抗氧化、增强免疫力和抗肿瘤活性等多种生物活性[3]。传统提取多糖的方法有很多种，如热水浸提法、碱液提取法[4]等。由于多糖成分大多为细胞内产物，提取时大多需要进行细胞破碎，而现有的机械和化学方法有时难以取得理想的破碎效果。并且传统水浴浸提多糖存在提取时间长、提取效率低的缺点。目前，对桦褐孔菌多糖提取的研究还不够深入，还需要进一步的试验和探索。本文通过超声波振荡处理对桦褐孔菌多糖的提取工艺条件进行优化，旨在为开发和利用这种药用真菌提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

桦褐孔菌子实体，购自吉林省长白山地区。

1.1.2 主要试剂

无水乙醇(黑龙江省双城市鑫田化学试剂制造有限公司生产)，95%乙醇(黑龙江省双城市鑫田化学试剂制造有限公司生产)，乙醚(沈阳市华东试剂厂生产)，苯酚(天津市巴斯夫化工有限公司生产)，浓硫酸(黑龙江省阿城试剂厂生产)，无水葡萄糖(中国药品生物制品检定所生产)。所有试剂均为市售分析纯。

1.1.3 仪器

DHG-9245A电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司生产)，PDZ5-WS低速多管架自动平衡离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司生产)，755B紫外可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司生产)，NR-C26WF1冰箱(松下公司生产)，HHS型电热恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂生产)，BS124S电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司生产)，通风橱(北京森雷博瑞实验室设备有限公司生产)。

1.2 方法

1.2.1 多糖提取流程

桦褐孔菌粉末→ 超声波振荡预处理→ 恒温水浴抽提2次→ 离心分离(4000rpm，15min)→取上清液并浓缩(至10ml)→醇沉过夜(40 ml 95%乙醇)→ 离心取沉淀 → 无水乙醇洗涤→ 乙醚洗涤 →离心(4000rpm，10min)→ 常规干燥多糖。

1.2.2 多糖提取率测定方法：采用苯酚-硫酸法[5]

1)原理。糖在浓硫酸的作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定。在波长490 nm处和一定范围内其吸光度与多糖提取率呈线性关系正比。从而可以利用分光光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品多糖的含量。

2)葡萄糖标准曲线的绘制。精确称量葡萄糖于容量瓶中，混匀后定容。分别量取葡萄糖标准溶液，制成一定的浓度梯度并置于干燥试管中，分别以蒸馏水补至相同的体积，再分别加入6%苯酚溶液0.5mL，摇匀。然后加浓硫酸2.5mL，充分摇匀，室温放置20min，在490nm处测得其相应的OD值。以糖含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘出葡萄糖微克数与OD值之间的标准曲线，得回归方程和线性范围。

3)样品含量测定。准确称取桦褐孔菌多糖5 mg，蒸馏水溶解后定容于50 ml容量瓶中，吸取1.0 ml 样品溶液，再依次加入0.5 ml 6%的苯酚溶液和2.5 ml浓硫酸，振荡摇匀。沸水浴加热15 min后冷却至室温，然后在490 nm处测吸光度，计算样品溶液多糖的含量。

4)样品多糖提取率的计算。多糖提取率(%)=(糖浓度×体积×稀释倍数/样品糖质量)×100%。

1.2.3影响多糖提取率的因素

1)超声波振荡时间对多糖提取率的影响。取5份菌粉，每份2g在超声波破碎仪中处理时间分别为5 min，10 min，15 min，20 min，25 min，提取温度90℃，料液比1∶20条件下进行样品提取实验，测定其多糖提取率。

2)提取温度对多糖提取率的影响。取5份菌粉，每份2 g超声振荡时间均为20 min，在水提温度分别为50℃，60℃，70℃，80℃，90℃，料液比1∶20条件下进行样品提取实验，测定其多糖提取率。

3)料液比对多糖提取率的影响。取5份菌粉，每份2g超声振荡时间均为20min，提取温度均为90℃，在料液比分别为1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60的条件下进行样品提取实验，并测定其多糖提取率。

1.2.4 多糖提取工艺的优化

采用正交实验法：选用超声时间(A)、提取温度(B)、料液比(C) 三个因素，每个因素三个水平，进行L9(34)正交试验，因素水平见表1。

表1 正交试验因素与水平

2.1 糖含量的测定结果

2.1.1葡萄糖标准曲线

将配制好的葡萄糖标准液按照比例混合摇匀，放在沸水浴中煮沸15 min，冷却至室温后，以2.0 ml蒸馏水作为空白对照于490 nm处测各管的OD值。相同的步骤做三组平行实验，取平均值。绘出葡萄糖浓度与OD值之间的标准曲线，如图1。

曲线的绘制：y=4.7978×10x+4.18×10-2(R2=0.9976) 其中x为糖浓度，y为吸光度，R为相关系数。

2.2 单因素实验结果

2.2.1超声波振荡时间对多糖提取率的影响

改变超声波振荡时间对多糖溶液提取率的影响如图2所示。超声时间单因素实验结果表明：超声时间对多糖溶液提取率的影响较大。随着超声时间的延长，提取率曲线变化较规则，在振荡时间5～15 min之间，提取率大幅增大，在15 min处达最大，之后缓慢减小。因此，振荡时间15 min为最佳的工艺参数。

图1 葡萄糖标准曲线

图2 超声时间对多糖提取率的影响

2.2.2水浴浸提温度对多糖提取率的影响

改变水浴浸提温度对多糖溶液提取率的影响如图3所示。提取温度单因素实验结果表明：提取温度对多糖溶液提取率的影响也较大，随着温度的升高，提取率逐渐上升，当温度达到 70℃ 时为最大值；之后缓慢减小。因此，提取温度70℃ 为最佳的工艺参数。

图3 提取温度对多糖提取率的影响

2.2.3料液比对多糖提取率的影响

改变料液比对多糖溶液提取率的影响如图4所示。料液比单因素实验结果表明：随着溶剂量的增大，提取率逐渐上升，当料液比达到1∶50时为最大值，之后减小。因此，料液比1∶50为最佳的工艺参数。

图4 料液比对多糖提取率的影响

2.3 正交实验

根据单因素实验结果，以超声时间(A)、提取温度(B)、料液比(C)三个因素进行桦褐孔菌多糖提取的正交实验。每个因素选取三个水平进行L9(34)的正交实验见表2。

表2 正交实验结果表

表3 正交实验的方差分析表

从极差分析可知：RA>RC> RB，所以影响多糖提取率的因素次序为A >C> B，即影响多糖提取率的主要因素是超声时间，其次是提取温度，影响最小的是料液比。根据正交实验结果，确定较优的提取条件为超声时间20 min，料液比为1∶50，提取温度60℃。在最佳工艺条件下实验所得多糖的提取率为5.03%，从方差分析表3中发现各因素均不显著。

2.4 对比实验

在不进行超声振荡处理的条件下，按照传统的热水浸提法对桦褐孔菌多糖进行提取，所得的提取率为3.17%。而经过超声波振荡处理，在最佳工艺条件下实验所得多糖的提取率为5.03%。如表4结果表明：通过超声波振荡处理能有效地提高桦褐孔菌多糖的提取率。

表4 对比试验

[参考文献]

[1] 黄年来.俄罗斯神秘的民间药用真菌-桦褐孔菌[J].中国食用菌,2002,21(4):7-8.

[2] 金光,杨恩月,洪淳赞.桦褐孔菌多糖抗肿瘤作用的实验研究[J].延边大学医学学报,2004,27(4):257.

[3] MIZUNOT, ZHUANGC, ABEK, et al. Antium or and hypo-glycemic activities of polysaccharides from the scleritia and mycelia of Inonotus obliquus [J]. Int J Med Mushrooms,1999,1(4):301-316.

[4] YONGOOKKIM, SANG BAEHAND, HONGWOEN LEE, et al. Immune-stimulating effect of the endo-polysaccharide produced by submerged culture of Inonotus obliquus [J].Life Sciences,2005,77:2438-2456.

[5] 孙素兰,俞励平,叶青山.超声波法提取灵芝袋泡茶多糖的实验研究[J].食品与药品,2006,8(1):52-54.

[6] Zhang L X, Fan C, .Chemical composition and antitumor activity of alkali-extracted polysaccharide from Inonotus obliquus[J]. Journal of Medicinal Plants Research,2011,5(7):1251-1260.