凝胶渗透色谱净化-气相色谱分离同时测定饲料中3 0种有机磷农药残留

韩 梅

(四川省农科院分析测试中心，四川成都 641400)

有机磷农药作为一类高效、广谱的杀虫剂、除草剂被广泛地用于农业生产中,但其使用后可能会残留在农作物上，另一方面，某些有机磷如敌敌畏会作为驱虫剂添加在饲料中[1]。将不可避免地在饲料的加工生产和流通中形成残留而造成污染[2]，这些农药残留物，可长期随饲料进入人、畜机体，影响动物性食品的安全[3]，危害人体健康，所以饲料中有机磷农药残留的检测具有重要的意义。当然饲料中农药残留不是饲料质量安全的主流，但是及时了解和掌握动物饲料中的农药残留状况，监测农药残留的来源，关注可能存在的饲料质量安全风险隐患，可以防患于未然[2]。近年来，关于饲料中的多种有机磷农药的凝胶色谱净化及检测方法与技术，在国内研究的不多，有用丙酮提取[9]，硅胶层析柱净化，火焰光度检测器（FPD）检测，有用乙酸乙酯提取[5]，有用乙腈提取直接上机[6]，有用QuECh ERS方法净化，质谱检测器检测[7-8]。在本文中考虑到混配饲料成分复杂，采用乙腈提取，凝胶渗透色谱净化,火焰光度检测器（FPD）检测,初步建立混配饲料中常见的30种有机磷农药残留的测定方法。

1 试验材料与方法

1.1 仪器与试剂

气相色谱仪(美国AgiLent7890A)，配有FPD检测器、7683B自动进样器；凝胶渗透色谱仪（美国J2 Scientific）,配有内充Bio-Beads S-X3玻璃柱(内含凝胶22 g,20 cm×2 cm）;旋转蒸发仪（瑞士 Büchi），离心机。样品为混配饲料。

丙酮、乙腈均为色谱纯；乙酸乙酯、环己烷为分析纯，去离子水；氯化钠为分析纯;敌敌畏等30种有机磷农药标液购于北京中国标准技术开发公司标样开发部,均为 100 mg/l。

标准溶液的配制：将30种农药逐一准确吸取一定体积的标液分别注入一容量瓶中，用丙酮稀释定容至刻度，配制单一农药储备液。采用同样方法配制农药混标储备液。根据实验需要，用丙酮稀释成不同浓度的混合标准工作液。

1.2 色谱条件

色谱柱：DB-50+石英毛细管柱 (30 m×0.25 mm×0.25 μm), 载气为氮气(纯度＞99.999%)，恒流；流量2.0 ml/min。空气流量120 ml/min，氢气流量75 ml/min。柱温：初温100℃，保持1 min，以25℃/min升至200℃，再以8℃/min升至240℃，保持10 min。进样口温度230℃；检测器温度250℃；尾吹流量60 ml/min。进样方式为不分流进样；进样量1.0 μl。

1.3 实验方法

1.3.1 样品提取及浓缩

取试样5.0 g（过20目筛）置于50 ml离心管中，加入10 ml水充分湿润，放置30 min后加入20 ml乙腈，涡旋混合，匀浆1 min，再加入氯化钠3～5 g，再匀浆1 min，将离心管以 4 200 r/min速度离心30 min，准确吸取离心后的上层清液10.0 ml收集到鸡心瓶中，40℃水浴旋至近干，用环己烷：乙酸乙酯(1：1)溶剂置换1～2次，准确取10.0 ml乙酸乙酯：环己烷（1：1 v/v）溶解残渣，过0.45 μm滤膜，供凝胶净化。

1.3.2 凝胶色谱(GPC)净化

净化试验选择了2.0 mg/l的混合标样用环己烷：乙酸乙酯（1：1）置换1～2次，直接过凝胶渗透色谱柱，采用体积比为1：1的乙酸乙酯-环己烷作为流动相，进样量为5.0 ml，流速为4.7 ml/min，从7 min起每1 min收集流出液，共收集14份溶液，40℃水浴旋至近干定容，分别用气相色谱检测各段流出液中30种有机磷农药的含量。同时，样品提取液过凝胶净化时收集9～18 min流出组分于旋蒸瓶中，40℃旋转蒸发至近干，用丙酮定容至2.5 ml，供气相色谱测定。

1.3.3 标准系列制备方法

分别吸取混合标准储备液用丙酮稀释，配成0.05～2.0 μg/ml的标准系列使用液。按照1.2色谱分析条件进行测定，进样量为 1.0 μl。

2 结果与讨论

2.1 提取方法的选择

农药残留分析中常用于提取农药的有机溶剂有丙酮、乙腈、乙酸乙酯和二氯甲烷等,有些溶剂对人体的毒性较大如二氯甲烷[4]，长期接触会给实验分析人员的健康造成一定的危害；有些溶剂如丙酮的极性太强，在提取农药的同时也将大量的杂质提取出来，不利于后续的净化。本方法选用对人毒害性较低的乙腈作为提取溶剂,既能保证提取的油脂、色素等杂质较少又对农药有广泛溶解性，有利于分析人员的身体健康。另外，对于提取方式，通常的机械振荡所需的时间较长,一般需要几十分钟,而高速匀浆机匀浆只需1～2 min，且提取效率比前者更好，本文选匀浆方式提取饲料中的农药。

2.2 样品净化条件的选择

净化是饲料样品中30种有机磷农药残留检测方法研究中的关键步骤。因为混配饲料是根据养殖对象营养需要，将多种营养成分的饲料原料按一定比例科学调配、加工而成的饲料。除了五谷杂粮，通常还添加有鱼粉、肉骨粉，其中含有一定量的油脂和多糖等大分子组分的复杂基质，提取后直接上机会污染仪器系统，导致仪器灵敏度下降。柱层析等净化方法不能有效地将干扰杂质除去，且操作步骤繁杂。但是选用填料为中性、多孔的Bio-Beads SX-3作为GPC柱填料，使用自动化GPC系统不仅能进行有效的分离净化，而且还大大节约了时间和溶剂[4]。本实验选用体积比为1：1的乙酸乙酯-环己烷溶液作为流动相,流速为4.7 ml/min，按1.3.2方法每1 min收集一份样品,共收集14份样品溶液,分别进行GC-FPD检测各段流出液中组分的含量，发现9 min以前的收集液中未检出农药,第10 min的收集液中开始检出农药,大部分有机磷农药在11～14 min流出，有较高的回收率，15～17 min只有丙溴磷和硫环磷组分还有流出，18 min以后的收集液中未检出农药。另一方面，通过对空白样品分段流出液的分析，大部分的大分子杂质如脂肪在9 min以前就去除了，考虑到凝胶色谱柱保留时间的波动性，可在农药流出的时间段前后多截取1 min，因此,选定样品过凝胶柱净化的收集时间为第9～18 min共收集10 min流出液。

空白样品萃取液经过GPC净化GC-FPD检测，其色谱图见图1。图2为GPC净化收集9～18 min馏分时农药添加色谱图,从图中看出30种有机磷农药能够有效的分离，分离效果好，达到了农残分析的要求。

2.3 线性关系、检出限

称取已知不含农药的饲料样品,按照本法的提取净化条件经GPC净化并旋至近干后,分别向其中添加一定体积的2 mg/l的30种农药的混合标准溶液,配制成一定质量浓度系列标准溶液,与空白样品同时进行测定,以各组分的峰面积(A)对质量浓度(C,mg/l)绘制标准曲线。同时,以最低质量浓度点的响应值与空白样品中噪声响应的3倍计算最低检出限(LOD)，方法的线性关系、检出限结果见表1。表1中的数据表明,在0.05～2 mg/l质量浓度范围内,方法的线性关系良好,相关系数均大于0.99，30种农药的最低检出限为5.6～54 μg/kg。

2.4 方法的精密度和回收率

定量添加上述30种农药的混合标准溶液于空白饲料样品中，添加浓度分别为0.050、0.10、0.20 mg/kg，每一浓度水平下作3个平行样。添加后按照“1.3”节所述步骤进行提取、浓缩、净化和测定,试验结果见表2。

表2中的数据表明，30种农药在所有添加水平下的平均加标回收率为71.3%～114.1%，相对标准偏差(RSD%)为0.3%～14.8%(n=3)，在添加水平低的情况下其RSD%较大。

表1 30种农药的保留时间、线性方程、相关系数和检出限

表2 方法的添加回收率和精密度(n=3)

3 结论

本文建立了GPC净化，GC-FPD快速检测饲料中30种有机磷农药残留的方法。使用凝胶渗透色谱净化技术,能够去除饲料样品中脂肪和色素等大分子杂质，操作简单，自动化程度高，能够满足大量样品的快速检测要求，另一方面FPD检测器有足够的灵敏度和选择性可很好地用于饲料中多种有机磷的测定。

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