鲜牛奶中细菌的分离纯化及其药物敏感性分析

张晓梅

(天津科技大学生物工程学院工业微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津300457)

近年来,随着生活水平的提高，人们消费奶制品的结构有了很大的变化,传统的奶粉市场逐渐下滑,液态奶（包括巴氏杀菌奶、UHT奶、保持灭菌奶、酸奶等）市场上升显著，对原料奶的要求也越来越高[1-2]。

鲜牛乳中的微生物种类是细菌、酵母菌和少数霉菌。细菌包括乳酸菌、胨化细菌、产气菌、产碱菌、霉菌和酵母菌。乳酸菌是奶中数量最多的微生物,约占奶中微生物总数的80%,它能分解乳糖,引起乳酸发酵,使乳变酸，主要包括乳酸链球菌、乳脂链球菌、粪链球菌、嗜热链球菌、保加利亚乳酸杆菌、瑞士乳酸杆菌、干酪乳酸杆菌和嗜酸乳杆菌；胨化菌能产生酶,并在其作用下,使牛奶形成非酸性凝固,产生腐败味，主要包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、荧光假单胞菌、腐败假单胞菌；产气菌能分解碳水化合物,生成乳酸及其他有机酸,产生二氧化碳和氢气，使牛奶形成酸性凝固,并带有多孔气泡,产生臭味，主要包括大肠埃希氏杆菌、产气杆菌等，通常总称为大肠菌群；产碱菌能分解牛乳中有机酸，造成乳的pH值上升，主要包括粪产碱杆菌、粘乳产碱杆菌；病原菌包括金黄色葡萄球、霍乱菌和无乳链球菌等[3]。

在奶牛养殖过程中，因环境卫生、季节变换和饲料等的原因，奶牛经常患有各种疾病，如感冒、乳房炎、子宫炎、胃肠炎等[4]。在疾病治疗过程中，主要使用青霉素、庆大霉素、四环素等抗生素[5]，但由于耐药菌株的出现使疗效甚微，加大使用剂量会造成奶中药物残留严重。为了解健康奶牛的牛奶中微生物分布及奶牛在日常管理过程中抗生素的使用对牛奶的影响，本实验通过对河北省张家口地区健康奶牛新鲜牛奶中微生物的分离鉴定和药敏试验,初步了解张家口地区牛奶中细菌的分布及其抗生素使用情况。

1 材料与方法

1.1 材料

张家口地处河北西北部，位于东经113°50′～116°30′，北纬 39°30′～42°10′。本实验从河北张家口地区某奶牛养殖场采集新鲜无菌牛奶30份，采样过程严格遵守无菌操作规程：先把牛奶收集到无菌EP管（1.5 ml）中，每次采集的量为1～1.3 ml。采样前先用温水清洗乳房，继用0.2%新洁而灭，再用75%酒精消毒乳头，挤去头三把奶，以排除一些污染的杂菌[6]。然后在记录本上记录编号和乳区位置。将采集好样品的EP管密封保存于4℃条件下，尽快送回实验室进行样品处理。

1.2 培养基及试剂

Luria-Bertani培养基、抗生素，购于北京鼎国生物有限责任公司；血琼脂平板，Mueller-Hinton（MH）培养基购于天津市金章科技发展有限公司。

1.3 细菌的分离纯化

将4℃保存的样品做梯度稀释：先将EP管中的样品振荡混匀，取1 ml样品原液加到盛有9 ml无菌生理盐水的无菌试管中，震荡混匀制成1：10的样品匀液。再吸取1：10样品匀液1 ml，加到盛有9 ml无菌生理盐水的无菌试管中，震荡混匀制成1：100的样品匀液。重复上述操作至合适稀释度后，取100 μl均匀涂布在Luria-Bertani（LB）平板上，36℃恒温连续培养5 d,每隔12 h观察并记录菌落形态及计数。

1.4 溶血实验

溶血素(hemolysin／haemolysin)又称细胞溶素(cytotoxill)。确切地说它是细胞溶素中的一部分，细胞溶素是指细菌分泌的能够使细胞溶解的毒素。溶血素不仅溶解红细胞，还损害其它多种类型的真核细胞，包括血小板、成纤维细胞、心肌细胞、单核细胞、粒细胞、内皮细胞等。此外，一些溶血素是公认的毒力因子，可使细菌产生致病力[7]。

用接种针挑取分离得到的细菌单菌落在血琼脂平板上划线，36℃恒温培养24 h后观察并记录实验结果。

1.5 细菌的16s rRNA鉴定

1.5.1 细菌DNA的提取按文献[8-10]采用CTAB法提取菌株基因组总DNA①细菌培养：将菌株活化后接种于5 ml LB培养液里，37℃培养过夜。

②细菌收集：取1 ml培养物于1.5 ml EP管中，室温8 000 r/min离心5 min，弃上清液，尽量吸净上清液。

③悬浮菌体：向菌体沉淀中加入500 μl 1×TE Buffe（rpH值8.0），反复吹吸，使沉淀重新彻底悬浮。

④细胞壁的破裂：向每管中加入6 μl 50 mg/ml的溶菌酶37℃作用2 h。

⑤菌体裂解：加入10%SDS和20 mg/ml蛋白酶K 3 μl于 37 ℃温育 1 h。

⑥去除多糖成分：加入5 mol/l NaCl 100 μl和CTAB/NaCl溶液80 μl于65℃温育10 min。

⑦抽提：加等体积的氯仿/异戊醇（24：1）混匀，室温放置 5～10 min，4 ℃、12 000 r/min离心 10 min。

⑧再次抽提：将上清液移至干净离心管。加等体积的酚/氯仿/异戊醇（25： 24： 1）混匀，室温放置 5～10 min，4 ℃、12 000 r/min离心 10 min。

⑨沉淀：取上清液移至干净管中，加1倍体积预冷的异丙醇，轻轻混合，室温放置5～10 min，4℃12 000 r/min离心10 min，弃上清液得到DNA沉淀。

⑩洗涤：用70%的乙醇（v/v）洗涤DNA沉淀2次，并在空气中自然干燥。

⑪溶解：最后将沉淀的DNA溶于100 μl的无菌去离子水中。

1.5.2 Polymerase Chain Reaction（PCR）反应

①反应体系：ddH2O：29.6 μl；10×buffer（without Mg2+）：5 μl；MgCl（225 mM）：5 μl；dNTP（2.5 M）：4 μl；16S-F：2 μl，16S-R：2 μl；Taq 酶（5 U/μl）：0.4 μl；DNA模板：2 μl。

引物序列为[11]：

16S-F：AGAGTTTGATCATGGCTCAG

16S-R：GGTACCTTGTTACGACTT

②反应条件[11]：95℃预变性5min；94℃变性2 min，55℃ 退火 1 min，72℃ 延伸 1.5 min，30个循环；72℃延伸 10 min。

将PCR产物送至测序公司测序。

1.6 药物敏感性实验

根据CLSI药物敏感性试验解释标准将分离纯化的细菌采用微量肉汤稀释法测定青霉素、氯霉素、克林霉素、红霉素、四环素、庆大霉素、环丙沙星、头孢噻吩8种常用抗生素的最小抑菌浓度（MIC）。

1.6.1 菌悬液的制备

将过夜培养的菌液用生理盐水或MH肉汤稀释，校正为0.5麦氏比浊标准，即菌液浓度约为(1～2)×108CFU/ml，在此基础上将菌液再稀释10倍，即所得菌液浓度为(1～2)×107CFU/ml。

1.6.2 抗生素贮存液的制备

将实验用抗生素分别用配制成2 560 μg/ml的贮存液，存于-20℃冰箱备用。

1.6.3 微量药敏板的制备

向无菌96孔板的第1个孔中加40 μl MH肉汤，其余每孔100 μl，在第1个孔中加160 μl抗生素贮存液（2 560 μg/ml），混匀后取 100 μl至第 2 个孔，混匀后取100 μl至第3个孔，如此连续稀释至13孔，并从第13孔中吸取100 μl弃去，第14和15孔为不加抗生素的对照，其中第14孔为生长对照孔，第15孔为培养基对照孔。此时，每孔抗生素的浓度分别为1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 μg/ml。

1.6.4 菌液的接种

在每孔中加入制备好的菌悬液各100 μl，使菌液中浓度约为5×105CFU/ml。每孔抗生素浓度为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/ml。

1.6.5 培养及判断标准

将接种后的96孔板置于35℃恒温培养16～20 h后观察结果。在不搅动的情况下，与对照孔按下列标准比较:肉眼观察清晰，为100%受抑制；略模糊，为80%受抑制；浊度显著减低，为50%受抑制；浊度轻度减低，为20%受抑制；浊度不减低，为未受抑制。根据CLSI推荐的分界点值标准，判断耐药（resistant，R）、敏感(susceptible，S)或中介（intermediate，I）。

2 结果

2.1 细菌的分离结果

根据细菌在LB平板上的不同形态颜色，30份牛奶样品中共分离纯化得到111株菌，将其分别提取DNA，并进行16S rRNA扩增，结果如下。

将PCR产物进行测序，结果如下。

表1为测序后在NCBI上进行Nucleotide Blast的部分结果，其中表（a）为分离得到的111株菌的类型及所占比例；（b）为葡萄球菌的比对结果；（c）为假单胞菌的比对结果；（d）为沙雷氏菌的比对结果。

表1 细菌分离鉴定结果

(c)假单胞菌比对结果细菌形态类圆形，干燥，褶皱凸起，边缘锯齿状，浅黄色编号JN585674.1 JF923455.1 JF923453.1 HQ680964.1 JF834289.1描述Pseudomonas stutzeri strain RA10 Pseudomonas sp.DGM MC2 Pseudomonas sp.DGM UTI1a Pseudomonas stutzeri strain 53 Bacterium enrichment culture clone phytdeg18同源度100%100%100%100%100%(d)沙雷氏菌比对结果细菌形态圆形，湿润，光滑，有光泽，凸起，边缘整齐，白色编号JN545838.1 JF310707.1 HM161859.1 HM045833.1 HM136580.1描述Serratia marcescens strain YXJ-1002 Serratia sp.CC-SMTG-4 Serratia marcescens strain 2BGN4 Serratia sp.WJ09 Serratia marcescens strain SA1同源度99%99%99%99%99%

2.2 溶血实验结果

用接种针挑取分离得到的细菌单菌落在血琼脂平板上划线，36℃恒温培养24 h后，结果显示，α溶血为12株，占10.81%；β溶血为21株，占18.92%；γ溶血为78株，占70.27%。

2.3 药敏实验结果

根据CLSI推荐的判断标准，结果显示，耐青霉素16 μg/ml的为50株，耐氯霉素32 μg/ml的为23株，耐克林霉素 4 μg/ml的为 46株，耐红霉素 8 μg/ml的为37株，耐四环素16 μg/ml的为38株，耐庆大霉素16 μg/ml的是 7 株，耐环丙沙星 4 μg/ml的为 8 株，耐头孢噻吩32 μg/ml的为40株。

表2 CLSI中判断标准（μg/ml）

分离得到的111株菌中，同时耐8种抗生素的0，耐7种抗生素的为2株，耐6种抗生素的为14株，耐5种抗生素的为27株，耐4种抗生素的为36株。

表3 各类细菌耐药结果(株)

3 讨论

鲜牛乳中的微生物种类是细菌、酵母菌和少数霉菌。细菌包括乳酸菌、胨化细菌、产气菌、产碱菌、霉菌和酵母菌。而细菌的类型主要有葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、乳酸杆菌、假单胞菌、肠球菌、微球菌[12]，还有少数的蜡状芽孢杆菌及克雷伯菌属细菌[13]。

引起牛乳房炎的因素很多，包括物理、化学及微生物学等因素，常提到的乳房炎主要指微生物作用乳腺组织所引起的炎症。奶牛乳房炎的病原菌种类非常复杂，与地域、季节和饲养管理条件等密切相关。即使是同一奶牛场，不同时期的病原菌种类及比例也不一样。能引起乳腺组织炎症的微生物种类极其繁多。目前，已发现约有150种病原微生物可引起奶牛乳房炎[14]。牛乳房炎的主要病原菌有金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、棒状杆菌等[15-16]。

实验分离得到的细菌有葡萄球菌、沙雷氏菌、假单胞菌、芽孢杆菌、肠杆菌、不动杆菌、奇异变形杆菌、微球菌、巨球菌、肠球菌等。细菌类型与文献报道的基本一致，且无金黄色葡萄球菌，无乳链球菌等细菌的检出，说明实验所采集的样品基本正常，奶牛无患乳房炎症状。

实验中α溶血为12株，占10.81%；β溶血为21株，占18.92%；γ溶血为78株，占70.27%。α+β溶血共占29.73%，说明在分离所得细菌中致病菌并非主要菌群。

实验分离得到的致病菌少且无金黄色葡萄球菌等引起牛乳房炎的病原菌，主要是因为该奶牛养殖基地地处偏僻，且为散养形式，即每户养殖几头奶牛，独立饲养、管理和挤奶，集中时间和地点交奶，这就在一定程度上对牛舍、牛体的卫生有了保证，并且减少了挤奶过程中病原菌的交叉感染机率。

MIC实验结果显示，所分离的细菌对各种抗菌素都有不同程度的耐药。8种抗生素中，庆大霉素、环丙沙星、氯霉素的抑菌效果较好，而对常用的青霉素、克林霉素、四环素等的抑菌效果相对差一些。

随着抗菌药物的广泛应用，耐药菌株的增多，细菌对常用抗生素的耐药性愈来愈强，这给治疗奶牛疾病的选择用药带来很大困难。本实验发现的细菌类型和抗生素抗菌效果为该养殖地区的进一步管理和用药提供了科学指导。

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