降钙素基因相关肽在大鼠切牙和牙周组织中的表达

张 静，吕琳琳，孙 静，陈家芳，李 纾，2

(山东济南250012:1.山东大学口腔医学院;2.山东大学口腔医学重点实验室)

降钙素基因相关肽(CGRP)是一种具有强大扩张血管作用的生物活性多肽［1］，广泛分布于周围、中枢神经系统和心血管系统。近年来研究显示:CGRP在口腔组织中的分布具有不可忽视的意义，其在正常牙髓中的阳性表达，提示这类神经肽具有神经递质和放大刺激传入信号的作用，从而导致疼痛和过敏症状［2］，同时CGRP还可调节牙髓中的血管生成以修复牙髓组织。此外，CGRP在口腔种植和正畸治疗的牙槽骨愈合过程中也扮演着重要角色，并且受到了越来越多的关注。但是关于CGRP作为一种神经性因子在牙齿硬组织发育过程中的作用研究和报道较少。本研究通过观察CGRP在大鼠切牙成釉细胞、成牙本质细胞和牙周膜细胞中的组织学定位和表达，为进一步研究CGRP在牙齿硬组织发育调控过程中的意义提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 主要材料和仪器

6周龄雄性Wistar大鼠(山东大学动物中心提供);CGRP一抗(abcam，美国);山羊超敏二步法免疫组化检测试剂盒、DAB显色试剂盒、胰蛋白消化液(北京中杉金桥生物技术有限公司);LEICA RM2135切片机(德国);OLYMPUS BX71显微镜和照相系统(日本)。

1.2 取材和标本处理

取6周龄雄性 Wistar大鼠，水合氯醛注射［0.4 mL/100 g(体质量)］麻醉后用40 g/L多聚甲醛心脏内灌注处死并内固定，取双侧下颌骨置40 g/L的多聚甲醛中再固定12 h，流水冲洗1 h后置100 g/L的EDTA液中脱钙60 d，经针刺无阻力后终止脱钙。取含切牙的组织块，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋，颊舌向连续切片(片厚5 μm)，展片后用多聚赖氨酸预处理的载玻片捞片，烤片3 h后置4℃冰箱内保存备用。

1.3 HE 染色观察

选取上述切片脱蜡至水，苏木素染色10 min，流水冲洗5 min，40 g/L盐酸乙醇分色1 s，流水返蓝10 min，伊红染色3 min，流水冲洗至背景干净，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察并进行图像采集。

1.4 免疫组织化学染色观察

利用HE染色确定组织结构后，选取相邻的切片参照山羊超敏二步法免疫组化检测试剂盒说明进行CGRP的免疫组织化学染色。切片脱蜡至水，0.1 mol/L PBS冲洗3 min×3次;30 mL/L过氧化氢室温孵育10 min以阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗3 min×3次;滴加抗原复合消化液，37℃孵育20 min，PBS冲洗3 min×3次;滴加 CGRP一抗(1∶00)稀释液，4℃过夜，复温 5 min，PBS冲洗3 min×3次;滴加聚合物辅助剂，室温孵育15 min，PBS冲洗3 min×3次;滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育15 min，PBS冲洗3 min×3次;滴加DAB显色液，显色后立即用双蒸水冲洗，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片(阴性对照以PBS代替一抗重复以上步骤)。显微镜下观察、照相，并按以下采集标准进行结果分析:①细胞质内无淡黄色和棕黄色颗粒，苏木素复染后细胞核呈蓝色，细胞质空白者界定为CGRP阴性表达;②细胞质内有淡黄色颗粒或者阳性着色不超过10%，界定为弱阳性表达;③细胞质内有棕黄色颗粒或者阳性着色占组织的60%以上则界定为强阳性表达。

2 结果

2.1 组织学观察

成釉细胞排列呈栅栏状，细胞核极性倒置，处于分泌期。成牙本质细胞位于牙本质内侧，牙周膜细胞位于成釉细胞外侧，沿纤维方向规则排列，细胞呈长梭形(图1)。

2.2 免疫组织化学染色结果

CGRP在牙周膜细胞中呈阳性表达，在胞浆中有淡黄色颗粒(图2);在分泌期成釉细胞和成牙本质细胞中呈强阳性表达，胞浆中有棕黄色颗粒。(图2～3)周围牙槽骨的骨细胞中呈阴性表达;PBS阴性对照组中牙周膜细胞、成釉细胞和成牙本质细胞均呈阴性，胞浆透明，胞核蓝染(图4)。

图1 大鼠切牙组织学观察

图2 成釉细胞和牙周膜细胞CGRP免疫组织化学染色

3 讨论

CGRP是Rasenfeld等［3］首次利用基因重组技术合成的一种具有生物活性的神经肽，并且在随后的研究中发现广泛分布于周围神经和中枢神经以及一些非神经系统组织中。CGRP由37个氨基酸组成，相对分子质量为3800 D，与肾上腺素、淀粉样多肽同为降钙素基因相关肽超家族的一员。CGRP受体分为CGRP 1和CGRP 2两类，主要通过G－蛋白偶联受体来实现生物多样性并调节功能［4］。CGRP主要源于感觉神经纤维，由脊髓后根神经节神经元细胞产生，通过轴浆运输到神经末梢并储存在胞浆中。

研究发现:CGRP在口腔组织中的分布也较为广泛，在牙髓、牙周膜和牙槽骨中的成纤维细胞、血管周围均有阳性分布，并且能够调节牙周组织和牙髓的血流量。近年的研究显示:CGRP在骨生长活跃部位的分布明显多于其他部位［5］，并且能抑制破骨细胞的活性而抑制骨吸收;也可诱导破骨细胞的增殖而促进骨改建［6］。

在牙齿发育过程中，釉质上皮细胞作为一个屏障过滤器能选择性的为釉质的形成提供钙运输［7］。Gill等研究发现:CGRP能明显增强豚鼠心房钙内向电流并提高心肌细胞中胞内钙［8］。Jacobsen等报道:切除大鼠牙齿的感觉神经会影响牙本质的生成，表明CGRP在牙本质形成过程中可能也具有一定的作用［9］。本研究显示:CGRP在分泌型成釉细胞和成牙本质细胞中呈强阳性表达，与以上的研究结果相符，就此可以推测CGRP在釉质和牙本质矿化形成过程中可能具有一定的调控作用;再根据Gudermann等报道的CGRP可通过G蛋白偶联受体影响细胞的分化、增殖和转化［10］，因而也可推测CGRP在成釉细胞和成牙本质细胞中的表达可能对牙齿硬组织发育过程中细胞的增殖分化具有一定的意义，但仍需要进一步的研究探讨。

［1］Caviedes－Bucheli J，Lombana N，Azuero－Holguín MM，et al.Quantification of neuropeptides(calcitonin gene－related peptide，substance P，neurokinin A，neuropeptide Y and vasoactive intestinal polypeptide)expressed in healthy and inflamed human dental pulp［J］.Int Endod J，2006，39(5):394 －400.

［2］李亚奇，宗颖，范小平.CGRP和NGF在正畸加力后人牙髓中的表达［J］.牙体牙髓牙周病学杂志，2010，20(8):441 －444.

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［8］Gill JS，Moonga BS，Huang CLH，et al.Voltage－sensitive elevation of cytosolic［Ca2+］in guinea－pig cardiac myocytes elicited by calcitonin gene－related peptide［J］.Exp Physiol，1992，77(6):925–928.

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［10］Gudermann T，Grosse R，Schultz G.Contribution of receptor/G protein signalling to cell growth and transformation［J］.Arch Pharmacol，2000，361(4):345 －362.