Myo5a特异性片段原核表达重组质粒的构建

游荷花，沈敬华

（1.山西医科大学 汾阳学院，山西 汾阳032200；2.内蒙古医学院，内蒙古 呼和浩特010000）

Myo5a，染色体定位：15q21，是肌球蛋白重链12条（MYH12）。它是一种“摩托蛋白”，在细胞内物质运输中发挥重要作用，属于肌球蛋白家族中MyosinV中的一员，是依赖微丝运动参与细胞内物质运输的。Myo5a是此家族中新发现的成员，为肌球蛋白提供了新的研究方向。最近的研究发现Myo5a可能与一些肿瘤的发生有关［1］。为进一步研究Myo5a与肿瘤的发生有无相关性，本研究构建Myo5a特异性片段的原核表达重组质粒PGEX－4T－3／Myo5a，并进行了鉴定，以期为后续研究Myo5a的作用提供研究工具。

1 材料与方法

1.1 材料

Myo5aDNA模板，原核表达载体PGEX－4T－3，大肠杆菌菌株DH5α均来自本实验室。BamHⅠ、XhoⅠ等DNA限制性内切酶，T4DNA连接酶均由Takara公司提供。质粒小量提取试剂盒，胶回收试剂盒均由AXYGEN公司提供。

1.2 设计引物并合成

根据GenBank的人类Myo5a基因全序列，设计合成一对引物来扩增Myo5a羧基端第5077－5208碱基对长131bp的小片断。在上游引物PF的5′端添加BamHⅠ识别序列和保护序列，在下游引物PR的5′端添加XhoⅠ识别序列和保护序列。引物序列如下：

PF／BamH Ⅰ 5′－CG／GGATCC／ATGTTCTACATCATAGGG－3′

PR／XhoⅠ5′－CCG／CTCGAG／CAGATTCTTGTCACGCAG－3′

1.3 通过聚合酶链式反应（PCR）扩增Myo5a特异性小片断

在冰上将0.5μL的Myo5aDNA模板，2μL的引物，1μL的dNTP，0.5μL的 DNA 聚合酶（Vent酶），5μL的缓冲液，41μL的DI H20构成50μL体系加入PCR管中。先95℃预变性2 min。然后95℃变性15s，50℃退火30s，72℃延伸45s，此三步循环30次。然后4℃保温。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。得到所需扩增片段后使用RCR纯化试剂盒提纯DNA。

1.4 克隆目的基因

将上述PCR产物、质粒载体PGEX－4T－3分别进行BamH I和X ho I双酶切，酶切后的产物经胶回收试剂盒纯化；之后利用T4DNA连接酶在4℃过夜条件下将Myo5a基因小片段与质粒载体PGEX－4T－3按一定比例相连接。取连接反应液分别转化到预先制备的大肠杆菌DH 5α感受态细胞，均匀涂布菌液于含氨苄青霉素的LB培养基平皿上，37℃培养12～16h。

1.5 阳性重组质粒的筛选与鉴定

1.5.1 PCR鉴定重组质粒

从上述LB培养基上随机挑取数个菌落，之后分别接种含氨苄青霉素的LB液体培养基的试管中，剧烈振摇培养37℃过夜。从各管中分别取菌液以PF、PR作为引物，直接PCR反应。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，能扩增出Myo5a基因片段者为阳性重组质粒克隆。

1.5.2 酶切鉴定重组质粒

对经PCR筛选、鉴定正确的阳性重组质粒克隆用质粒小量提取试剂盒提取重组质粒DNA，然后进行BamH I和Xho I双酶切，鉴定目的基因是否插入载体中，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.6 基因序列测定鉴定重组质粒

北京诺塞基因组研究中心有限公司使用双脱氧链终止法全自动测序仪对PCR鉴定及酶切鉴定均正确的重组质粒进行测序。

2 结果

2.1 PCR扩增Myo5a基因特异性片段

以人类Myo5a基因全序列为模板，采用PCR技术扩增出与预期大小一致约131bp的DNA片段（图1）。

2.2 重组质粒的筛选并鉴定

2.2.1 重组质粒的PCR鉴定

对LB平皿上随机挑取的菌落进行PCR扩增鉴定，大部分扩增出约131bp大小的DNA片段（图2）。

图1 PCR产物的电泳分析Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products expression

图2 重组质粒的PCR鉴定Fig.2 PCR identification of the recombinant plasmid expression

2.2.2 重组质粒的酶切鉴定

用BamH I和Xho I对PCR鉴定正确的重组质粒进行双酶切，可见约4900bp的大片段和约131 bp的目的片段。（图3）。

图3 重组质粒的双酶切鉴定Fig.3 Restriction enzyme digestion identification of the recombinant plasmid expression

3 结论与讨论

肌球蛋白V分子是“Y”字结构，有两条完全相同的重链。它由头部、颈部、尾部3个功能部位组成。颈部较长，尾部较短，每条重链颈部有3条调解轻链和3条必需轻链，而尾部顶端的位点可以和运输物质相结合［2］。电镜下看到提纯的脑肌球蛋白Va的存在方式是双头聚合体［3］。MyosinV是“非传统”的线性马达，不同于其它线性马达，它的颈部区域较长大约24nm［4］，因而步子比较大。最近研究表明MyosinV类蛋白在无中间丝的情况下，运动“步伐”会变大、同时速度也会变快，提示中间丝网状结构所形成的粘滞力有可能阻碍了细胞器间的运输［5］。

Provance等实验发现，老鼠的肌球蛋白V基因免疫缺陷时会表现表皮颜色变淡或导泻，此外，受影响的老鼠会出现严重的神经问题，几周后就会死亡，认为冲淡的表皮颜色是由于黑色素颗粒从黑色素细胞到发光毛发运输的缺损所致［6～8］。这表明存在于色素细胞中的黑色素的运输与肌球蛋白V是有关的，肌球蛋白V沿着肌动蛋白微丝连续运动，此过程利用的是水解ATP产生的自由能。也有研究证明人类“Griscelli病”是因为MyosinV基因突变导致了轻色素沉着，共济失调以及各种免疫缺陷和神经系统的症状［10］。肌球蛋白V在细胞内主要负责有被小泡和黑色素等微粒的运输。当这种马达发生故障时就会导致神经或免疫等方面的疾病［9］。近几年的研究又发现Myo5a可能与一些肿瘤的发生有关。

本研究用多聚酶链式反应（PCR）扩增出Myo5a基因特异性片段的蛋白编码序列，经BamH I和Xho I进行双酶切后，将此片段插入原核表达载体pGEX－4T－3，构建重组子PGEX－4T－3／Myo5a。通过PCR、限制性酶切和基因测序3种方式证实获得了原核重组载体PGEX－4T－3／Myo5a，不仅可以为后续研究Myo5a的作用提供研究工具，同时也可以为深入研究非常规肌球蛋白在肿瘤细胞转移中的作用及其分子调控机制提供理论基础。

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