芽孢杆菌LP－3抗菌物质的初分离及抑菌活性测定

张宝俊，张家榕，韩巨才，刘慧平

（1.山西农业大学 农学院，山西 太谷030801；2.山西农业大学 生命科学学院，山西 太谷030801）

植物内生芽孢杆菌能分泌多种抗菌物质，在植物病害生物防治中具有良好的应用前景［1］。近年来国内外学者先后从植物内生芽孢杆菌中分离到脂肽、细菌素、抗菌蛋白等多种抗菌物质，并对其抑菌活性、抑菌机理及分子结构等进行了研究［2～4］，为该类微生物在植物病害生物防治中的应用提供了研究基础，但真正应用到生产中的数量有限，其主要原因一是拮抗菌抗菌物质的代谢量较少、抑菌活性低，缺乏应用开发的基础；二是抗菌物质稳定性差，从而限制了其应用。因此筛选高活性拮抗菌株，并对其分泌的抗菌物质进行研究将会促进植物内生菌的开发及应用。本试验前期从梨树内分离到1株拮抗芽孢杆菌LP－3，该菌株对多种植物病原菌具有抑菌作用，为分析其抗菌物质的类型及抑菌活性，本研究采用不同有机溶剂对该菌株分泌的抗菌物质进行提取，并对抗菌粗提物的抑菌活性进行分析，研究结果为进一步开发及利用该抗菌物质奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株及病原菌

LP－3菌株分离于山西农业大学果园梨树木质部。梨黑斑病菌Alternaria alternata、黄瓜黑斑病菌Alternaria cucumerina、玉米黑粉病菌Ustilago maydis、番茄灰霉病菌Botrytis cinerea、辣椒疫病菌Phytophthora capsici、番茄早疫病菌Alternaria solani、黄瓜枯萎病菌Fusarium oxysporium f.sp.cucumerinum、辣椒枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum 和小麦赤霉病菌Fusarium graminearum 等9种病原菌为山西农业大学化保实验室保存菌种。

1.1.2 供试药剂

97.8%腐霉利、50% 异菌脲（如东县光荣合成化工厂）。

1.2 最佳萃取溶剂的筛选

将LP－3种子发酵液按1%的比例接种于BPY培养液中，30℃、160r·min－1振荡培养72h，10 000r·min－1离心10min去除菌体获得发酵液，分别用等体积的氯仿、乙酸乙酯、苯、石油醚萃取，甲醇萃取采用“酸沉醇提”的方法［5］。各萃取3次，合并有机相，在40℃条件下旋转蒸发至干。用甲醇溶解并定容至10mL，0.45μm微孔滤膜过滤后以梨黑斑病菌为指示菌，生长速率法测定各有机相及水相的抑菌活性。

1.3 粗提物与杀菌剂对病菌菌丝毒力比较

粗提物设 1.25mg·L－1、6.25mg·L－1、12.5mg·L－1、25mg·L－1和50mg·L－15个浓度梯度；腐霉利设0.625mg·L－1、1.25mg·L－1、6.25mg·L－1、12.5mg·L－1和25mg·L－15个浓度梯度；异菌脲设25mg·L－1、50mg·L－1100mg·L－1、200mg·L－1和500mg·L－15个浓度梯度，将各浓度药液分别与PDA培养基按1∶9的比例混合制备含药平板，接入梨黑斑病菌菌块，25℃恒温培养5d后分析各药剂对梨黑斑病菌菌丝生长的抑制作用。

1.4 粗提物与杀菌剂对病菌孢子毒力比较

采用悬滴法，制备浓度为3.0～5.0×105个·mL－1的梨黑斑病菌孢子悬浮液，分别与不同浓度的腐霉利、异菌脲和LP－3粗提物药液混合，使其终浓度为0.625mg·L－1、1.25mg·L－1、2.5mg·L－1、5mg·L－1、10mg·L－1，28℃保湿培养12h后，观察孢子的萌发情况，测定3种药剂对梨黑斑病菌孢子萌发率的影响。以芽管长度超过孢子直径一半计为萌发，每处理3次重复。

1.5 LP－3粗提物抗菌谱测定

依据预实验中不同病原菌对粗提物的敏感性的不同设定不同浓度梯度，并与分别与PDA培养基按1∶9的比例混合制备含药平板，接入直径为5mm的病菌菌块，25℃恒温培养5d，测定各处理的菌落直径，用DPS6.0软件分析粗提物对9种植物病原真菌的毒力，以无菌水为对照。

2 结果与分析

2.1 最佳萃取溶剂筛选结果

试验结果如图1所示，5种有机溶剂萃取物对梨黑斑病菌的抑制率差异明显，其中甲醇的萃取效果最佳，其有机相对梨黑斑病菌的抑制率为68.4%，水相抑菌率为35.9%，表明大多抗菌物质溶于甲醇中，苯的萃取效果较差，其有机相对梨黑斑病菌的抑制率仅为11.3%，而水相抑菌率高达60.4%，5种有机溶剂萃取物的抑菌率依次为甲醇＞三氯甲烷＞乙酸乙酯＞石油醚＞苯。为达到对抗菌物质分离纯化的目的，选择用甲醇为萃取溶剂对LP－3菌株分泌的抗菌物质进行大量萃取。

图1 5种有机相和水相抗菌活性Fig.1 Antagonistic activities of extracts from five different solvent extractions

2.2 粗提物与杀菌剂对菌丝毒力测定结果

由表1可见，LP－3抗菌粗提物、腐霉利和异菌脲对梨黑斑病菌菌丝生长的抑制中浓度分别为1.18mg·L－1、0.34mg·L－1和14.41mg·L－1，该粗提物对梨黑斑病菌菌丝生长具有较强的抑制作用，其EC50小于生产上常用药剂异菌脲对梨黑斑病菌菌丝的EC50，虽然稍高于腐霉利对病菌菌丝的EC50，但该抗菌物质为微生物的分泌代谢产物，与环境有很好的相容性，因此具有一定的开发潜力。

2.3 粗提物与杀菌剂对孢子毒力测定结果

由表2可见，LP－3抗菌粗提物、腐霉利和异菌脲对梨黑斑病菌孢子萌发的抑制中浓度分别为3.61mg·L－1、3.56mg·L－1、5.69mg·L－1，LP－3抗菌粗提物对孢子萌发的抑制效果介于腐霉利和异菌脲之间，表现出良好的抑菌活性。

表1 LP－3粗提物与杀菌剂对梨黑斑病菌菌丝的毒力Table 1 The toxicity of LP－3extractions and fungicides against hyphal growth of A.alternata

2.4 LP－3粗提物抗菌谱测定结果

经测定该抗菌粗提物对9种植物病原真菌均有一定的抑制活性（表3），其EC50在1.18～67.93 mg·L－1之间，其中对梨黑斑病菌的抑制作用最强，抑制菌丝生长的 EC50为1.18mg·L－1，对番茄早疫病菌、小麦赤霉病菌和黄瓜黑斑病菌菌丝生长的EC50分别为5.53mg·L－1、7.08mg·L－1和7.32mg·L－1，对番茄灰霉病菌和辣椒枯萎病菌的抑制作用稍差，EC50分别为52.57mg·L－1和67.93mg·L－1。研究结果表明，该抗菌物质的抗菌活性较高，抗菌谱较广。

表3 LP－3粗提物对9种病原菌的毒力Table 3 The toxicity of LP－3extractions against nine pathogenic fungi

3 结论与讨论

本研究从内生芽孢杆菌LP－3中分离的抗菌物质不但可以抑制梨黑斑病菌菌丝的生长，而且对梨黑斑病菌孢子的萌发也有一定的抑制活性，对梨黑斑病菌的抑菌活性甚至优于其常用防治药剂异菌脲对病菌的毒力。该抗菌物质抗菌谱较广，对9种不同植物病原真菌均有一定的抑制作用。

芽孢杆菌在农业生产上的应用主要集中在两个方面：一是分离抗菌物质，将其开发为相关制剂应用于生产［6］；二是筛选适宜的拮抗菌株，直接在大田施用。美国迄今已有多株枯草芽孢杆菌生防菌株用于田间植物病害的防治，我国现已成功开发并投入生产的商品制剂包括亚宝、麦丰宁、百抗、纹曲宁等［7］，但高效、稳定生防菌株的筛选仍是限制生防制剂开发的一个关键因素，近年来国内外学者从植物内生菌中筛选出一些具防病促生功能，且稳定性好的生防菌株，Nejad等［8］分离的内生细菌不但能促进油菜、番茄幼苗的生长，而且对番茄枯萎病菌、棉花黄萎病等病原菌有拮抗作用。黎起秦等［9］从番茄茎标本分离到1株芽孢杆菌，经室内和田间防治初步测定，该菌株对番茄青枯病有较好的防治效果。乔勇升［10］从茄子植株中分离获得1株内生枯草芽孢杆菌对茄子黄萎病菌具有较强拮抗活性，温室盆钵试验证明对黄萎病防治效果可达80%以上。本研究分离的梨内生细菌LP－3不但对梨黑斑病菌具有良好的抑制效果，而且对所测其它植物病原菌也具有一定的抑制活性，为该菌株及其次生代谢产物的进一步开发奠定了基础。关于该菌株的田间防效及其抗菌物质的类型、抑菌机理等尚需进一步的分析。

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