小鼠紫外线皮肤损伤模型的建立及T4N5给药实验

章伟韬，曹 宇，梅 翔，陈海容，范 开，

(1.重庆理工大学 药学与生物工程学院 ，重庆 400054;2.重庆富进生物医药有限公司，重庆 400041)

T4核酸内切酶 V(T4 endonuclease V，简称T4N5)是 T4噬菌体感染宿主 E.coli后由基因DenV表达的一种DNA修复酶。该分子含有138个氨基酸残基，理论分子质量为16.0785 kDa。它能特异性地识别DNA胸腺嘧啶二聚体，并在该损失部位切断磷酸二酯键，从而启动体内的DNA切除修复途径，从而有效防止紫外线辐射引起皮肤病变［1］。

脂质体是一种药物载体新剂型，由磷脂、胆固醇等为膜材包合而成。脂质体可以将药物粉末或溶液包埋在直径为纳米级的微粒中，这种微粒具有类细胞结构，在人体体表可以直接与细胞膜结合，从而提高上皮细胞对药物的吸收度［2］。运用脂质体包埋的T4N5能够有效穿透皮肤角质层，直达皮肤患处。

本实验对T4N5抗紫外线损伤作用进行了动物学实验研究。实验使用的T4N5采用融合表达制备［1］，为脂质体凝胶。实验动物为昆明小鼠，褪毛后皮肤暴露于固定强度的紫外线下照射，观察对照组、模型组、给药组和安慰剂组皮肤组织变化情况，并予以分析讨论。

1 实验材料与方法

1.1 材料

动物:昆明小鼠32只，购于重庆医科大学实验动物中心，7周龄，体质量40 g左右，雌性，按清洁动物标准条件分笼饲养。

主要仪器:UVB紫外线灯管，型号为TL20W/12RS，荷兰PHILIPS公司生产;紫外线照度计，型号为UV2000，杭州远方光电信息有限公司生产。

实验药物:T4N5脂质体凝胶，委托重庆富进生物医药有限公司生产，批号20101104，蛋白浓度0.2 mg/mL，4℃保存;安慰剂脂质体凝胶，委托重庆富进生物医药有限公司生产，批号20101001，4℃保存。

1.2 实验动物的造模

1.2.1 动物分组及前处理。昆明小鼠随机分笼，分为4组:① 对照组;② 照射组;③ 安慰剂组;④照射给药组。用苦味酸进行标记。在小鼠背部剪去体表长毛，用0.2 g/mL硫化钠处理［3］，进行脱毛，脱毛区约为3.0 cm ×5.0 cm。

1.2.2 紫外线损伤模型的建立。除第①组外，对其余各组小鼠进行以下实验:开启UVB紫外线灯，预热15 min，使光源发出的紫外线强度稳定［4］;固定光源距小鼠背部距离约为25 cm，紫外线辐照度计测定辐照强度为0.35 mW/cm2;每天照射2次，每次照射30 min，间隔时间为12 h;实验周期为10 d，总辐照量为12.6 J/cm2;照射期间停止给水给食，照射后0.5 h恢复。

1.2.3 实验动物的饲养管理。所有小鼠按清洁动物标准条件分笼喂养，饲喂鼠颗粒饲料，饮水为灭菌生活饮用水。饲养温度20～22℃，湿度50% ～60%，保持换气通风［5－6］。实验期间不进行自然采光，采用红光照明，防止细胞 DNA光修复的发生［7］。

1.3 实验动物的给药

从第4 d照射起，第③组和第④组开始给药，给药时间为照射后15 min，给药量为0.25 mL/次，给药方式为外用，方法为用灭菌棉签均匀涂抹于照射部位。

1.4 图像采集

在第10 d最后一次实验后，对所有小鼠脱毛区照射部位进行图像采集。

1.5 组织学标本采集

图片采集后，用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射，麻醉小鼠，手术取下实验照射部位皮肤，立即浸入10%福尔马林中，固定24 h后取出，HE染色后浸蜡、包埋，然后切片［8］。

2 实验结果

2.1 皮肤表面图像分析

4组小鼠的皮肤情况(图1):对照组小鼠皮肤光滑细腻，未见明显病理性变化;照射组和安慰剂组小鼠表皮出现大面积红斑，并且结痂皴裂、起皱;UVB照射给药组小鼠皮肤光滑细腻，肉眼可见少量红斑。

图1 小鼠脱毛区照射部位图像

2.2 组织学标本

HE染色切片(图2)显示:对照组、UVB照射给药组小鼠皮肤较薄，真皮内主要细胞有成纤维细胞和巨噬细胞;UVB照射表皮及真皮层坏死，表皮层增厚，组织结构紊乱，皮脂腺及毛囊明显减少，有局部增生，皮下组织水肿，伴有中性粒细胞浸润。

图2 小鼠脱毛区照射部位HE染色(10×40)

3 结束语

本研究表明，T4N5修复酶具有良好的修复皮肤紫外线损伤的能力，可有效减少了紫外线UVB造成的皮肤损伤。目前国内尚未有将T4N5修复酶应用于药学和生物医学方面的文献报道。在国外，美国TPSG公司将T4N5包埋于脂质体中，作为护肤产品的主要成分;美国AGI公司开发的T4N5脂质体已在皮肤癌的预防和治疗中进入III期临床试验［9］。随着T4N5脂质体重组制备工艺的完善和成熟［1］，将其开发成修复紫外线所致的皮肤损伤的药物或者化妆品将具有可观的经济价值和临床应用前景。

［1］范开，陈海容.融合表达重组制备T4核酸内切酶V［P］.中国专利，申请号201010552859.5.

［2］杨彤.新型脂质体的研究进展［J］.医药导报，2009(3):336-338.

［3］朱彦君，冯光珍.皮肤光老化动物模型的建立［J］.中国体视学与图像分析，2004，9(1):51-54.

［4］朱愉，多秀瀛.实验动物的疾病模型［M］.天津:天津科技翻译公司出版，1991:557-559.

［5］郭鲁义，李春雨.实用光老化动物模型建立方法的探讨［J］.中国美容医学，2008，17(2):235-237.

［6］张璃，梁虹.小白鼠皮肤光老化模型的建立［J］.广东医学，2005，26(12):1642-1643.

［7］王镜岩，朱圣庚.生物化学:下册［M］.3版.北京:高等教育出版社，2002:406-437.

［8］杜卓民.实用组织学技术［M］.北京:人民卫生出版社，2001:8-294.

［9］Cafardi J A，Elmets C A.T4 endonuclease V:review and application to dermatology［J］.Expert Opinion on Biological Therapy，2008(6):829-838.