适合膜片钳电流测定的金铁锁原生质体制备技术

赵 欣，李 岩，王 丽 爽，张 宗 申

（大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连 116034）

0 引言

金铁锁（Psammosilenetunicoides）隶属石竹科金铁锁属，生长周期长、自然繁殖能力差，集中分布在高海拔、温差小的云南、贵州等西南部地区，是我国特有的单种属植物和传统的民族药用植物［1-2］。药用植物中很多药用成分都是次生代谢产物，而次生代谢与细胞生长和发育阶段、基因型和外界环境因素等都有很大关系。研究发现，分布于细胞膜上的各种离子通道参与细胞信号传导、生长等过程中，对细胞系列生理生化代谢具有重要影响［3］。目前，关于离子通道与药用成分次生代谢之间关系的研究报告很少。

本实验利用传统酶解法［4］和快速酶解法［5］制备金铁锁原生质体，并利用全细胞电流记录手段比较了两种方法获得的原生质体的质量，为后续探讨药用植物与其他植物在细胞膜离子通道上是否存在差异提供合适的研究材料。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金铁锁愈伤组织继代周期和培养条件按照参考文献［1］进行，培养基为MS+6-BA 1.0mg/L+2，4-D 0.5mg/L。

纤维素酶（Cellulase）R-10，购于上海三杰生物技术有限公司；纤维素酶RS，购于Yakult Honsha（Japan）；果胶酶（Pectolyase）Y-23，购于Seishin Pharmaceutical（Japan）。

1.2 方 法

1.2.1 传统酶解法

1.2.1.1 金铁锁愈伤组织原生质体的分离

参考刘强［4］、王丽爽［6］等的方法并略作修改。取继代13d 的愈伤组织1g，将其放入1 mL CPW-13M（101 mg/L KNO3，27 mg/L KH2PO4，246mg/L MgSO4·7H2O，1 480mg/L CaCl2·2H2O，13%甘露醇）溶液中暗孵育1h。加入10mL酶液（不同浓度组合的酶溶于CPW-8M 溶液中，pH 5.8），在24 ℃、60r/min的摇床上黑暗振荡酶解。

1.2.1.2 原生质的纯化［7］

酶液经200 目筛网过滤，800r/min 离心5min，弃上清液，重复3次，收集原生质体。原生质体悬浮于CPW-8M（101mg/L KNO3，27mg/L KH2PO4，246mg/L MgSO4·7H2O，1 480mg/L CaCl2·2H2O，8%甘露醇）洗涤液中，800r/min离心5min，弃上清液，重复3次。

1.2.2 快速酶解法

参照Pandey［5］的方法略作修改。取继代13d的愈伤组织0.5g，加入1mL 酶液（0.1mmol/L KCl，0.1mmol/L CaCl2，10mmol/L Asc，0.5%BSA，1.2%纤维素酶RS，0.5% Pectolase Y-23，渗透压用山梨醇调节至400 mmol/kg，pH 5.5）在22 ℃，45r/min的摇床上黑暗震荡反应15min，加入300μL 的基本介质（10mmol/L 谷氨酸钾，10 mmol/L Mes，1 mmol/L CaCl2，4mmol/L MgCl2，渗透压用山梨醇调节至400mmol/kg，pH 5.8）再反应5min后出现个别脱落的原生质体，加入等体积基本介质5min后，过双层滤网，然后450r/min预离心4min，去掉最上部2 mL 和最下部1 mL，取中间部分700r/min离心10min，保留最下面1mL，重复2次，收集原生质体。

1.2.3 金铁锁原生质体内向K+电流的测定

将0.5mL原生质体悬浮液加入到4.5 mL基本介质中，静置10 min，在倒置显微镜下选取胞质清晰、膜完整性良好的原生质体，移动含有电极液（80 mmol/L 谷氨酸钾，20 mmol/L KCl，10mmol/L Hepes，5 mmol/L ATP-Mg，渗透压用山梨醇调节至500 mmol/kg，pH 7.2）的玻璃微电极，添加适当负压，进行封接。刺激电压从-190mV逐渐去极化到+100 mV，每级为+20mV，维持时间3s，频率为0.2 Hz，全细胞封接形成10 min 后采集数据.使用Pulse+Pulsefit软件采集和分析全细胞电流［7］。

2 结果与讨论

2.1 传统酶解法制备金铁锁原生质体

2.1.1 酶液浓度组合对分离原生质体的影响

在不同浓度组合的酶液处理下，相同酶解时间，原生质体产率明显不同。由表1可见，原生质体的产率随着酶浓度的升高而有显著提升，在2%纤维素酶R-10+1%果胶酶Y-23组合下产率最高。当浓度继续提高时，原生质体的产率反而下降。每种植物细胞壁中纤维素和果胶的含量都不相同，需要选择最适的酶液组合浓度使原生质体的产率达到最高，但过高的酶液浓度反而会对制得的原生质体产生损伤，使其质膜迅速破裂、细胞内容物释放出来。

2.1.2 酶解时间对分离原生质体的影响

每隔1h，观察一次原生质体的酶解情况。酶解2h后就出现了少量的原生质体，随着酶解时间的延长，原生质体的数量不断增加，在7h时产率达到最高。随着时间的继续延长，原生质体数量开始减少，碎片不断增多，说明已经产生的原生质体破裂，整体瓦解了（见图1）。

表1 酶液浓度组合对原生质体分离的影响Tab.1 Effect s of enzyme concentration on separation of protoplasts

图1 酶解时间对原生质体分离的影响Fig.1 Effects of zymohydrolysis time on protoplast isolation

2.2 快速酶解法制备金铁锁原生质体

2.2.1 酶解时间对分离原生质体的影响

将酶液进行一定程度的稀释，可以精确控制酶解时间，即使酶解时间稍长，也会由于其浓度较低，使得对细胞膜的损伤较小。但如果将酶液浓度稀释很低，虽然可以更好地掌握酶解时间，但是由于时间过长，容易产生特别微小的细胞碎片和滋生微生物，将玻璃微电极的前端堵塞。如果不将酶液稀释，25min即产生大量的原生质体和碎片，在离心过程中高效的酶液依然发挥作用，一段时间后产生的原生质体大部分发生破裂。在酶液反应15min后，加入300μL 的基本介质将其稀释，继续反应5min后，大的细胞团开始脱落，继续加入1mL 基本介质将酶液进一步稀释，反应5min后，少数细胞变圆成为原生质体，但大部分的细胞仍有残余的细胞壁。在离心过程中残余的酶液会继续酶解部分细胞的细胞壁，虽然最终获得的原生质体数量较少，但由于酶解时间短，使细胞膜受到的损伤较小，完整性良好。

2.2.2 渗透压对分离原生质体的影响

将产生的原生质体放于300、350、400、450、500mmol/kg的基本介质中，4 ℃冰箱中过夜观察，结果见表2。由表2可知，4℃冰箱中过夜后，400mmol/kg下原生体保存的数量最多，且胞质饱满，细胞膜厚实圆滑。

表2 渗透压对原生质体分离的影响Tab.2 Effect of osmotic pressure on protoplasts isolation

2.3 不同酶解法下获得的原生质体对膜片钳实验的影响

传统酶解法虽然产生的原生质体较多，但因为细胞膜与酶液接触时间较长受到了不同程度的损害，使得制得的原生质体无弹性、易破碎，不适宜用于后续实验；并且因为酶解时间较长，分离纯化不够彻底，原生质体悬浮液中存在大量细小细胞碎片和滋生微生物，极易将玻璃微电极的前端堵塞。而快速酶解法获得的原生质体虽然数量较少，但与酶液直接接触的时间短，细胞膜受到的损伤很小，制得的原生质体完整、弹性好，静置1h左右就可以用于膜片钳实验，原生质体悬浮液中滋生微生物的可能性较小。综合考虑，快速酶解法制得的原生质体更适合作为膜片钳实验的材料。

2.4 金铁锁细胞原生质体的钾电流特征

静息电位是指细胞在未受刺激条件的非兴奋状态下的膜电位，在此情况下细胞膜主要处于钾离子平衡电位水平，静息电位主要由内向整流性钾离子通道参与形成的。在实验条件下，金铁锁细胞的静息电位在-52mV 左右，内向K+电流在100～350 pA，比拟南芥这一模式植物高100pA 左右，电流强度随刺激电压的变化而稳定平滑（图2），所以，快速酶解法制得的原生质体更适合作为膜片钳实验的材料测定细胞全电流。

3 结论

本文以金铁锁愈伤组织为材料，研究了两种不同酶解法制得原生质体的条件，并分析比较了两种不同酶解方法下制得的原生质体。

（1）利用传统酶解法制备金铁锁原生质体，产率随着酶浓度的变化先升高后降低，在2% 纤维素酶R-10+1% 果胶酶Y-23 下产率最高；原生质体的数量随着酶解时间的延长也是先增加后减少，在7h时产率最高。

图2 金铁锁原生质体全细胞质膜电流特征Fig.2 Characteristic of the whole-cell currents of P.tunicoides protoplasts

（2）快速酶解法制备原生质体，酶解时间短，相对于长时间处理，细胞膜受到的损伤小，完整性更好；4 ℃冰箱过夜、400mmol/kg渗透压下的原生体保存的数量最多，且胞质饱满，细胞膜厚实圆滑，同时认为快速酶解法制得的原生质体是进行金铁锁细胞膜片钳实验的良好材料，为后续的工作奠定了基础。