毛细管电泳法测定动物肝脏中的谷胱甘肽

刘开敏，王文坤，吴丽云

（1. 湄洲湾职业技术学院，福建 莆田 351254； 2. 南京军区莆田九五医院，福建 莆田 351100）

毛细管电泳法测定动物肝脏中的谷胱甘肽

刘开敏1，王文坤2，吴丽云1

（1. 湄洲湾职业技术学院，福建 莆田 351254； 2. 南京军区莆田九五医院，福建 莆田 351100）

建立了以0.07 mol·L-1Na2HPO4-0.07 mol·L-1KH2PO4的混合体系（pH7.38）为运行缓冲液，在230 nm紫外检测波长下，用毛细管电泳法测定鸡和猪肝脏中谷胱甘肽（GSH）的含量。结果表明：在最佳电泳条件下，GSH在5.0×10-6～1.0×10-3mol·L-1的范围内有良好的线性关系，r=0.999 7，最低检出限为1.6×10-6mol·L-1；加标回收率在94.81%～99.02%之间，RSD在1.56%～3.25%之间；该方法操作简便，快速，可靠性高，可用于动物肝脏中的谷胱甘肽含量的测定。

谷胱甘肽；毛细管电泳法；动物肝脏；磷酸盐缓冲液

谷胱甘肽广泛存在于动、植物中，在面包酵母、小麦胚芽和动物肝脏中的含量极高，以还原型（GSH）和氧化型（GSSG）两种形式存在。GSH可以清除新陈代谢产生的自由基，起到强有力的保护作用，具有保护肝脏、抗病毒、解毒及抗肿瘤作用，在细胞的多种基本代谢中起重要作用，GSH在食品、保健品等领域也有较大的应用前景[1]。目前，测定生物样品中 GSH的含量方法有高效液相色谱法[2,3]、分光光度法[4]、荧光分光光度法[5]、化学发光法[6]等。本文建立了具有高效、快速、准确、精密度好的毛细管电泳法（Capillary Electrophoresis，简称CE）测定了动物肝脏中的谷胱甘肽。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

高效毛细管电泳系统（WynSep，含数据处理软件），石英毛细管柱（华瑞博远），UP2200HE超声波清洗器（南京垒君达超声电子设备有限公司），离心机（长沙维尔康湘鹰离心机有限公司），pHS-3C型精密酸度计（上海精科仪器有限公司）。GSH标准品（纯度≥99%）、磺基水杨酸（SS）、磷酸二氢钾和酸酸氢二钠（分析纯），实验用水为超纯水。

1.2 GSH标准储备液的制备

精确称量GSH标准品0.307 3 g，加少量超纯水溶解，转移到100.0 mL容量瓶中，定容，将溶液通氮气除去氧气，放在 0℃冰箱内保存，此溶液的浓度为1.00×10-3mol·L-1。

1.3 样品溶液制备

取新鲜动物肝脏（鸡和猪）若干，洗净并捣成均浆，混匀，准确称取1.00 g置于烧杯中，加入适量的磺基水杨酸(SS)，使其pH在3.0～4.0之间，可有效防止GSH的氧化，加入少量超纯水，离心（3 000 r·min-1），上清液转移到1 000 mL容量瓶中，超纯水定容。再用微孔滤膜滤得清液，并通氮气除去氧气，放在0 ℃冰箱内保存待用。

1.4 磷酸盐缓冲液（简称PBS）的配制

分别配制 0.07 mol·L-1Na2HPO4和 0.07 mol·L-1KH2PO4溶液，按不同体积比混合成磷酸盐缓冲液。

1.5 实验方法

石英毛细管柱先用0.2 mol·L-1氢氧化钠溶液洗6 min，再用超纯水洗涤10 min，最后用PBS缓冲液洗涤15 min。在最佳CE条件（如表1所示）下进行电泳分析，得到GSH标准品和样品（鸡和猪肝脏）的毛细管电泳图，峰形对称良好，与样品中的其它组分可以达到有效分离，结果见图1。

表1 最佳电泳条件Table 1 The best condition of CE

图1 GSH标准品(a)与鸡肝脏(b)的毛细管电泳谱图Fig.1 Electropherogram of GSH standard sample (a) and sample (b:chicken liver)

2 实验结果与讨论

2.1 缓冲液的选择

分别比较磷酸氢二钠–柠檬酸、巴比妥钠–盐酸、硼酸–硼砂、磷酸二氢钾–氢氧化钠、磷酸盐(PBS)五种缓冲液对测试的影响，实验表明，采用磷酸盐（0.07 mol·L-1Na2HPO4和0.07 mol·L-1KH2PO4）缓冲液（体积比为4∶1，pH7.38），实验灵敏度最高。

2.2 分离电压的选择

分离电压的大小直接影响毛细管中的场强，迁移时间，柱效和焦耳热大小等。本文考察了电压范围在15～35 kV之间对GSH迁移行为的影响，结果见图 2。电压低时，迁移时间延长，电压太高，将导致分离度与柱效下降，经综合比较后，选择22 kV为最佳电压。

2.3 线性关系与检测限

在优化的实验条件下，GSH标准液C在5.0× 10-6～1.0×10-3mol·L-1的范围内与峰面积A有良好的线性关系，回归方程为 A=6.89×107·C－41.91，相关系数r=0.999 7，检出限为1.6×10-6mol·L-1，下限重复测定7次，测得迁移时间，峰面积和峰高的相对标准偏差（RSD）均小于2.5%。

2.4 样品分析

在最佳电泳条件下，按实验方法1.5测定由1.3方法制备的鸡和猪肝脏样品溶液中 GSH的平均含量及回收率，结果列于表2。

采用紫外分光光度法[4]测定上述鸡肝和猪肝样品中 GSH含量的作对比，得到鸡肝和猪肝样品中GSH含量分别为2.62 mg·g-1和3.10 mg·g-1。

图2 电压对GSH迁移行为的影响Fig.2 Effect of applied voltage on the separation of GSH

3 结 论

（1）在样品的预处理中，加入磺基水杨酸使溶液pH在3.0～4.0之间和通入氮气除氧气的目的是防止GSH的氧化；采用PBS磷酸盐缓冲液（pH7.38），仪器基线较为平直，背景噪声最小，灵敏度最高。（2）由表2可以看出，本法测定动物肝脏中GSH含量，加标回收率在94.81%～99.02%之间，RSD在1.56%～3.25%之间，具有较好的精密度和准确度， 适用于其它动物肝脏和水果中GSH含量的测定。

表2 样品中GSH的测定结果Table 2 Determination results of GSH in sample

（3）本法与紫外分光光度法测定鸡肝和猪肝样品中GSH含量作对比，测得含量基本一致，且该方法更快速、简便、精度优于紫外分光光度法。

［1］ 范崇东，王淼,等．谷胱甘肽测定方法研究进展[J].生物技术，2004，14(1)：68-70.

［2］ 杜小莉,等．HPLC测定还原型谷胱甘肽的血浆浓度[J].中国医药杂志，2005，40(6)：454-457.

［3］ 王爱月，解魁,等．高效液相色谱法测定保健食品中谷胱甘肽含量的方法研究[J].中国卫生检验杂志，2007，17(7)：1181-1182.

［4］ 翟文慧，王爱月．紫外分光光度法测定保健食品中谷胱甘肽[J].预防医学论坛，2005，11(5)：560-561.

［5］ 张静，吉宏武,等．荧光分光光度法测定海洋生物中的谷胱甘肽[J].湛江海洋大学学报，2005，25(4)：32-34.

［6］ 齐莹莹，吴莹,等．电化学发光猝灭法测定谷胱甘肽[J].光谱学与光谱分析，2005，25(2)：195-196.

Determination of Glutathione in Animal Livers by the Capillary Electrophoresis

LIU Kai-min1，WANG Wen-kun2，WU Li-yung1
（1. Meizhouwan Vocational Technical College,Fujian Putian 351254，China；2. Nanjing Military Command Putian No. 95 Hospital, Fujian Putian 351100，China）

A method for the determination of glutathione(GSH) in chicken and pig livers by the capillary electrophoresis with UV detection(230 nm) was developed. Determination of GSH was carried out by using the phosphate buffer system(PBS) containing 0.07 mol·L-1Na2HPO4–0.07 mol·L-1KH2PO4(pH7.38).The quantitative analysis was performed with external standard under the optimal conditions．The results show that the linear response range of this method is from 5.0×10-6mol·L-1to 1.0×10-3mol·L-1with r=0.999 7, and the detection limit is 1.6×10-6mol·L-1.The recovery rate is in the range of 94.81% ～ 99.02%, and the RSD is in the range of 1.56% ～ 3.25%.The method is simple, rapid, accurate and stable. The method can be used for determination of GSH in animal livers.

Glutathione；Capillary electrophoresis；Animal live；Phosphate buffer

O 658

A

1671-0460（2012）09-1003-03

2012-04-06

刘开敏(1973-)，男，福建莆田人，讲师，硕士，2008年毕业于福州大学化学化工学院分析化学专业，研究方向：从事工业分析和化学分析等技术工作。E-mail：13860907185@163.com