索氏提取-HPLC-ELSD法检测银杏叶片中萜类内酯的含量

高翠华，姜 恒

（辽宁石油化工大学 化学与材料科学学院，辽宁 抚顺 113001）

分析测试

索氏提取-HPLC-ELSD法检测银杏叶片中萜类内酯的含量

高翠华，姜 恒

（辽宁石油化工大学 化学与材料科学学院，辽宁 抚顺 113001）

建立一种基于索氏提取的绿色样品前处理技术，采用HPLC-ELSD法测定银杏叶片中总萜类内酯的含量。结果表明，银杏内酯A、B、C和白果内酯均有良好的线性范围，回收率均大于98%，检测量在52～108 ng之间，且方法具有较好的精密度、稳定性和重复性。辅料无干扰。本方法可有效用于银杏叶片中萜类内酯的提取与测定。

银杏叶片；萜类内酯；索氏提取-HPLC-ELSD法

银杏叶片系2005年药典收录的中药品种[1]，是由银杏叶提取物经加工制成的制剂，用于治疗心脑血管疾病及多种复杂性疾病，效果显著。萜类内酯是银杏叶片的主要成分之一，主要包括银杏内酯A（C20H24O9）、B（C20H24O10）、C（C20H24O11）和白果内酯(C15H18O8)[2,3]

银杏叶片中萜类内酯的含量极低，目前提取方法主要有三种：溶剂萃取法，溶剂萃取-柱层析法和超临界流体萃取法[4,5]，其中以溶剂萃取法应用最广泛，弊端是该方法需要采用大量的极性或中等极性的有机溶剂，严重污染环境。本次样品前处理方法采用索氏提萃取代替传统的液液萃取，采用加热的方式冷凝回流，减少有机溶剂使用量，保护环境。关于萜类内酯的含量测定方法主要有 TLC法，HPLC－UV法， HPLC－RI法， GC－MS法和HPLC-ELSD法等，其中HPLC-ELSD法是比较理想的一种方法[6,7]。本实验亦采用 HPLC-ELSD法，使用外标两点法对数方程分别计算白果内酯、银杏叶内酯A、银杏叶内酯B和银杏叶内酯C的含量，四种银杏内酯的含量之和即为总萜类内酯含量。

1 主要仪器与试剂

日本岛津 LC-10ATvp高效液相色谱仪，奥泰2000 ELSD检测器；甲醇，四氢呋喃和正丙醇均为色谱纯(国药集团有限公司)，乙酸乙酯为分析纯(国药集团有限公司)，水为重蒸馏水；银杏内酯A、B、C和白果内酯均购于中国药品生物制品检定所；银杏叶片由北京阜康仁公司提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性实验

色谱柱：C18柱，4.6 mm×250 mm，5μm（迪马公司, 钻石系列）；流动相：正丙醇-四氢呋喃－水（1∶35∶64）； 流速：1.0 mL/min；ELSD检测器，漂移管温度99.5 ℃，载气流速2.58 L/min；理论板数按白果内酯峰计算应不低于2 500,银杏内酯A与银杏内酯C峰的分离度应大于1.5。

2.2 色谱峰定位溶液的制备

取白果内酯，银杏内酯A，银杏内酯B和银杏内酯C对照品各约1 mg,分别加适量甲醇制成对照溶液，即得。

2.3 对照品溶液及供试品溶液的制备

分别精密称取白果内酯对照品，银杏内酯A对照品，银杏内酯B对照品，银杏内酯C对照品各约10, 5, 5, 5 mg，加甲醇制成每1 mL各2, 1, 1, 1 mg的混合溶液，即得对照品溶液。

取银杏叶片粉碎研细后粉末约5 g，精密称定，用定性滤纸包好，置索氏提取器中，加入20 mL乙酸乙酯和2%盐酸2滴，置80 ℃冷凝回流20 min，冷却，取出，回收醋酸乙酯至干，残渣用甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2.4 阴性对照试验

按工艺制备不含银杏提取物的阴性样品，照上述供试品溶液的制备方法制备成阴性对照品溶液，即得。分别精密吸取色谱峰定位溶液、对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见图1和图2。及塔板数符合规定，色谱峰从左到右依次是银杏内酯C、银杏内酯A、白果内酯和银杏内酯B,辅料无干扰。

图1 银杏叶片中萜类内酯的对照品图谱Fig.1 The chromatography of terpens lactones in standard solution

2.5 线形关系和线性范围的考察

取白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C对照品各约10, 5, 5, 5 mg，精密称定，置同一5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，分别精密吸取适量，注入液相色谱仪，记录色谱图，以进样量的对数为横坐标，峰面积的对数为纵坐标，绘制回归曲线， 试验结果表明：银杏内酯C在7.968 μg～27.888 μg范围内，银杏内酯 A在 8.272～28.952 μg范围内, 白果内酯在16.4～57.4 μg范围内，银杏内酯B在9.376～32.816 μg范围内，进样量的对数与峰面积的对数间均有良好的线性关系。

2.6 精密度试验

精密吸取同一对照品溶液20 μL，连续进样5次，记录色谱图，测定试验精密度，结果表明，连续5次进样，峰面积的RSD%均＜2.0%，说明本方法精密度良好。

2.7 稳定性试验

取银杏叶片样品，按上述供试品溶液的制备方法制备成供试品溶液，分别在0，2，4，6，8 h进样20 µL，记录色谱图，结果表明，RSD%分别为0.43%，0.86%，1.52%和0.65，说明本方法稳定性良好。

2.8 重复性考察

取同一批银杏叶片样品6份，按上述含量测定项下的方法测定含量，结果RSD%分别为1.06%，0.58%，1.41%和0.32，说明本方法重复性良好。

2.9 回收率试验

采用加样回收法测定。取已知含量的银杏叶片样品粉碎研细后粉末约2.5 g，精密称定，置索氏提取器中，再分别精密加入适量的银杏内酯C,银杏内酯A,白果内酯和银杏内酯B的对照品 （各约相当于2.5 g供试品所含的量）,依上法测定，计算回收率，结果见表1。实验结果表明：银杏内酯A, B, C和白果内酯的回收率分别为 98.76%，99.19%，99.83%和98.39%，即本法具有良好的回收率。

2.10 最低检出量

取重复性项下样品溶液1 mL，用甲醇溶液逐步稀释定，分别得到银杏内酯C，银杏内酯A，银杏内酯B和白果内酯的最小检出量分别为52.2, 147.8, 64.0, 73.4 ng.

2.11 银杏叶片含量测定

按照以上方法制备供试品溶液，测定3批中试样品（阜康仁制药公司提供）中萜类内酯的含量，每批样品测定两次，见表2。结果表明3批样品含量均＞ 2.4 mg/片，结合2005年版药典，含量符合规定[1]。

表1 银杏叶片中萜类内酯的回收率测定结果Table 1 The recovery results of terpens lactones in ginkgo leaves tablets

表2 银杏叶片中萜类内酯的含量测定结果Table 2 The concentration levels of terpens lactones in ginkgo leaves tablets

3 讨 论

3.1 检测方法的选择

关于萜类内酯的含量测定方法主要有TLC法，HPLC－UV法，HPLC－RI法和GC－MS法等。TLC法受环境和操作影响大，重现性差；而 GC-MS法需衍生化，操作复杂。HPLC法若采用普通紫外检测器，由于银杏内酯属末端吸收，测定干扰大。示差折光检测器（RI），为通用型检测器，但其对温度等外界因素响应过于灵敏，重现性和检测灵敏度差。ELSD为质量型通用检测器，能克服以上缺陷，近年来应用日趋广泛，故本品含量测定采用 HPLCELSD法。本文叙述了用HPLC-ELSD检测银杏内酯的含量，试验证明本方法重复性好，专属性强，灵敏度高，可准确的测定出银杏内酯A、B、C和白果内酯的含量，从而有效的控制样品的质量。采用ELSD检测器测定银杏内酯时,其峰面积值与样品进样量的线性关系不太理想,而将峰面积与样品进样量分别取对数后可得到理想的线性关系（这种现象与ELSD检测器的检测机理是一致的[9][10]），故本品含量测定采用外标两点法对数方程计算。

3.2 样品前处理方法的选择

本次实验采用乙酸乙酯索氏提取20 min。结果表明，2%盐酸和80 ℃高温作用下，萜类内酯在乙酸乙酯中溶解性良好，本方法重复性好，回收率高。同时，实验对比了索氏提取法和05版药典的液液萃取法，结果见表 3。可以明显看出：两者的回收率相当，均大于98%，但索氏萃取法的有机溶剂使用量却远远小于液液萃取法的使用量，且操作时间比较短。故最终选择采用索氏萃取法，萃取银杏叶片中的萜类内酯。

4 结 论

银杏叶的有效成分银杏内酯对治疗心脑血管疾病及多种复杂疾病时疗效确切，随着对银杏叶制剂研究的逐步深入和临床经验的不断积累, 它将能够更广泛地应用于治疗各种疾病, 是一种很有前途和价值的药物。我国是银杏树的主要产地, 我们应充分挖掘利用其资源, 让它为我国人民的健康和我国的医药走向世界做出更大的贡献。

表3 索氏提取法和05版药典方法比较结果Table 3 The comparison results between soxhlet extraction and standard detection method in pharmacopoeia of version 2005

本文叙述了用索氏提取-HPLC- ELSD法检测银杏叶片银杏内酯的含量。索氏提取简便高效，且节省溶剂，保护环境，HPLC-ELSD方法灵敏度高且选择性好。研究结果表明：本方法具有较好的线性范围，精密度，稳定性，重复性，回收率和低的检出限，可有效用于银杏叶片中萜类内酯质量控制。

［1］中国药典委员会.中国药典2005年版一部正文[M].北京：中国医药科技出版社,2005.

［2］张丽颖. 银杏叶的药理研究及临床应用近况[J]. 中国药事, 2006,20(2) :114-117.

［3］ 余新建,刘育文,高丽丽,朱文娟,刘星. 银杏内酯在心血管方面的应用研究探讨[J].中国医药导报, 2008,5(9):172.

［4］ 刘大伟,武文斌. 银杏叶中银杏内酯的提取,分离和测定方法研究[J].科技创新导报,2011(25):9.

［5］ 刘彬果,张新萍,刘岩.银杏叶片中萜类内酯类化合物的研究进展[J].药学实践杂志,2011,29(6):421-425.

［6］ 宋伟峰 李瑞明. HPLC- ELSD法测定银杏叶茶中总内酯的含量[J].药品鉴定,2011,18(5):40-43.

［7］ 肖飞,谭永霞,王永平,向阳, 赵娟.高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定银杏叶片中 4 种萜类内酯含量[J].医药导报,2011,29(5):675-677.

Determination of Terpens Lactones in Ginkgo Leaves Tablets by Soxhlet Extraction-HPLC-ELSD Method

GAO Cui-hua，JIANG Heng
（School of Chemistry and Materials Science,Liaoning Shihua University, Liaoning Fushun 113001，China）

A green sample preparation technique based on Soxhlet extraction was established, and then HPLC- ELSD method was used to determine terpens lactones content in Ginkgo tablets. The results show that there are good linear relationships between ginkgolide A, B, C and bilobalide, recoveries all are above 98% and the detection limit is 52～108 ng. The method has excellent precision, stability and reproducibility, so it has the potential ability for extraction and determination of terpens lactones in ginkgo leaves tablets.

Ginkgo Leaves Tablets; Terpens lactones; Soxhlet extraction-HPLC-ELSD

O 657

A

1671-0460（2012）09-0999-04

2012-03-12

高翠华（1981-），女，山东临沂人，硕士研究生，主要从事绿色化学相关方面研究。E-mail：gaoch200906@126.com。