草苁蓉中四种活性成分的提取与分析

董长颖 于加平

摘要：以体积分数为８０％的乙醇为提取剂，采用索氏提取法从草苁蓉（Ｂｏｓｃｈｎｉａｋｉａ ｒｏｓｓｉｃａ）中提取齐墩果酸、熊果酸和绿原酸，然后用热水提取法从残渣中提取多糖。运用高效液相色谱法对草苁蓉中齐墩果酸、熊果酸和绿原酸含量进行检测，再运用分光光度法对草苁蓉多糖含量进行测定。结果表明，草苁蓉中含有较丰富的齐墩果酸、熊果酸、绿原酸和多糖，其含量分别为０．５８６％、０．５７５％、０．３２６％、１１．８３５％；回收率分别为９６．９０％～９９．８０％、９７．２０％～１００．３０％、９７．５０％～１００．２０％、９４．３０％～９８．６０％；变异系数分别为１．１３％、１．２６％、１．１０％、１．７４％。

关键词：草苁蓉（Ｂｏｓｃｈｎｉａｋｉａ ｒｏｓｓｉｃａ）；高效液相色谱法；齐墩果酸；熊果酸；绿原酸；多糖

中图分类号：Ｒ２８４．２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）16－3579-05

The Extraction and Content Determination of Four Active Components in

Boschniakia rossica

ＤＯＮＧ Ｃｈａｎｇ－ｙｉｎｇ，ＹＵ Ｊｉａ－ｐｉｎｇ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｊｉｌｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｊｉｌｉｎ １３２１０１，Ｊｉｌｉｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｕｓｉｎｇ ８０％（ｖｏｌｕｍｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ） eｔｈａｎｏｌ ａｓ ｓｏｌｖｅｎｔ， ｏｌｅａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ， ｕｒｓｏｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｗｅｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｂｏｓｃｈｎｉａｋｉａ ｒｏｓｓｉｃａ ｂｙ ｓｏｘｈｌｅｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ； ｔｈｅｎ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｅｓｉｄｕｅ ｂｙ ｈｏｔ ｗａｔｅｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ． Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔs ｏｆ ｏｌｅａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ， ｕｒｓｏｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ were ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＨＰＬＣ； ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ ｖｉｓｉｂｌｅ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ Ｂ． ｒｏｓｓｉｃａ ｗａｓ ｒｉｃｈ ｉｎ ｏｌｅａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ， ｕｒｓｏｌｉｃ ａｃｉｄ， ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ａｓ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｗａｓ ０．５８６％，０．５７５％，０．３２６％ ａｎｄ １１．８３５％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｗａｓ ９６．９０％～９９．８０％， ９７．２０％～１００．３０％， ９７．５０％～１００．２０％ ａｎｄ ９４．３０％～９８．６０％ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ； ｗｈｉｌｅ ＲＳＤ ｗａｓ １．１３％， １．２６％， １．１０％ ａｎｄ １．７４％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂｏｓｃｈｎｉａｋｉａ ｒｏｓｓｉｃａ； ＨＰＬＣ； ｏｌｅａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ； ｕｒｓｏｌｉｃ ａｃｉｄ； ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ； ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ

草苁蓉（Ｂｏｓｃｈｎｉａｋｉａ ｒｏｓｓｉｃａ）俗称不老草，为列当科草苁蓉属多年生寄生性草本植物［１］，全草可用药［２，３］。主要分布在中国的北方地区，此外，在日本的富士山区、朝鲜的北部山区等地区也有分布［４］。现代药理学研究表明，草苁蓉具有补肾壮阳、润肠止血、滋补强身、延年益寿的功效［５］；主要用于治疗肾虚阳痿、腰膝冷痛、膀胱炎、功能性子宫出血、肾炎、前列腺炎以及肾脏和膀胱出血等疾病［６］。长期以来，人们对其进行了大量的科学研究，取得了很多的研究成果。但主要是对草苁蓉的挥发油和多糖方面的研究比较多，对药用价值极高、生物活性很强的齐墩果酸、熊果酸及绿原酸的研究很少。试验以草苁蓉为原料，对其中的齐墩果酸、熊果酸、绿原酸及多糖进行提取和含量测定，以便于科学地开发和充分地利用这一宝贵资源，更好地为社会服务，为人类造福。

１材料与方法

１．１材料

１．１．１原料草苁蓉购买于吉林省长春市参茸市场，其生长于吉林省延边朝鲜族自治州，经专家鉴定为草苁蓉，经阴干、低温烘干处理为干品，放于干燥器内备用。

１．１．２试剂甲醇、乙腈（色谱纯）购自天津市福晨化学试剂厂，乙酸、磷酸、无水乙醇、正丁醇、氯仿、浓硫酸和苯酚购自沈阳市新化试剂厂，齐墩果酸、熊果酸和绿原酸对照品购自中国药品生物制品检定所，葡萄糖购自天津化学试剂有限公司。

１．１．３主要仪器岛津ＬＣ－２０Ａ型高效液相色谱仪、Ｓｈｉｍａｄｚｕ岛津气相色谱仪工作站、岛津色谱柱（４．６ ｍｍ×２５０．０ ｍｍ，５ μｍ，十八烷基硅烷键合硅胶）、岛津色谱柱（４．６ ｍｍ×１５０．０ ｍｍ，５ μｍ，十八烷基硅烷键合硅胶）购自日本岛津株式会社，ＵＶ－１６００型记录式紫外－可见分光光度计购自北京瑞利分析仪器有限公司，索氏提取器购自上海洪纪仪器设备有限公司，ＥＳＪ２０５－４型电子天平购自沈阳龙腾电子有限公司，１０１－３型电热鼓风箱购自中国上海第二五金厂，Ａｎｋｅ ＴＧＩ－１６Ｂ型离心机购自上海安亭仪器设备有限公司，ＲＥ－５２ＡＡ型旋转蒸发仪购自上海亚荣生化仪器厂，ＳＨＢ－ＩＩＩＡ型循环水真空泵购自郑州长城科工贸有限公司，ＸＡ－１型固体样品粉碎机购自江苏省金坛市恒丰仪器厂。

１．２方法

１．２．１溶液的配制

１）齐墩果酸、熊果酸混合对照品溶液和绿原酸对照品溶液的配制。分别精密称取齐墩果酸、熊果酸和绿原酸对照品２２．４０、２０．３０和５．８０ ｍｇ，分别置于２５ ｍＬ容量瓶中，加甲醇后用超声波辅助溶解并定容，摇匀。取齐墩果酸、熊果酸对照品溶液各５ ｍＬ，置于１０ ｍＬ容量瓶中，摇匀。将齐墩果酸和熊果酸混合对照品溶液及绿原酸对照品溶液用０．２５ μｍ滤膜过滤，滤液即对照品溶液。齐墩果酸、熊果酸和绿原酸的浓度分别为０．４４８、０．４０６和０．２３２ ｍｇ／ｍＬ。

２）葡萄糖标准溶液的配制。准确称取于１０５ ℃干燥至恒重的葡萄糖标准品２５．００ ｍｇ，置于２５０ ｍＬ容量瓶中，用去离子水溶解、定容，摇匀，即得浓度为０．１０ ｍｇ／ｍＬ的葡萄糖标准溶液。

３）苯酚溶液的配制。取８０ ｇ苯酚，加０．１ ｇ铝片和０．０５ ｇ ＮａＨＣＯ３，蒸馏，收集１８２ ℃馏分［７］。称取６ ｇ，加水溶解，定容于１００ ｍＬ棕色容量瓶中，现配现用。

１．２．２草苁蓉中齐墩果酸、熊果酸、绿原酸与多糖的提取

１）草苁蓉中齐墩果酸、熊果酸和绿原酸的提取。将干燥的草苁蓉用粉碎机粉碎，称取２０．０００ ｇ，用滤纸包好，置于索氏提取器中，取体积分数为８０％的乙醇溶液１００ ｍＬ，先往索氏提取器中加体积分数为８０％的乙醇溶液至与虹吸管相平，剩余液体加入圆底烧瓶中，浸泡样品２ ｈ，然后在水浴锅上加热回流至无色，控制温度在７５ ℃左右。把回流液倒入１００ ｍＬ容量瓶中，超声波辅助溶解，过滤，定容，所得待测液放于冰箱中待用。

２）草苁蓉中多糖的提取与纯化。准确称取提取过齐墩果酸、熊果酸和绿原酸的草苁蓉残渣１５．０００ ｇ，置于５００ ｍＬ烧杯中，再加去离子水３００ ｍＬ，在水浴锅上加热提取３ ｈ，间歇搅拌，过滤，减压浓缩至１００ ｍＬ，用Ｓｅｖａｇｅ法［８］除蛋白质，过滤，将滤液调至ｐＨ ８．０，然后用Ｈ２Ｏ２法［９］脱色，脱色后用流动水透析４８ ｈ，透析液加无水乙醇使乙醇体积分数为８０％，于冰箱中静置过夜醇沉，再离心分离，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚各洗２次，最后真空干燥至恒重，即得精制的草苁蓉多糖。

１．２．３检测波长和流动相的选择

１）检测齐墩果酸和熊果酸的色谱条件。采用４．６ ｍｍ×２５０．０ ｍｍ的岛津色谱柱，用十八烷基硅烷键合硅胶作填充剂，填料粒度为５ μｍ，流速为０．５ ｍＬ／ｍｉｎ，柱温为２０ ℃。按齐墩果酸计，理论板数不低于５ ０００，按熊果酸计，不低于４ ０００。选择最佳的检测波长和流动相。

２）检测绿原酸的色谱条件。采用４．６ ｍｍ×１５０．０ ｍｍ的岛津色谱柱，用十八烷基硅烷键合硅胶作填充剂，填料粒度为５ μｍ，流速为１．０ ｍＬ／ｍｉｎ，柱温为２５ ℃。按绿原酸峰计算，理论板数应不低于４ ０００。选择最佳的检测波长和流动相。

１．２．４标准曲线的绘制

１）齐墩果酸和熊果酸标准曲线的绘制。精密吸取齐墩果酸和熊果酸混合对照品溶液５．０、７．０、９．０、１０．０、１３．０、１５．０ μＬ，进样并记录色谱图，以齐墩果酸和熊果酸混合对照品溶液的进样量为纵坐标，峰面积积分值为横坐标进行线性回归，得回归方程：■齐墩果酸＝７．１２２×１０－７ｘ－０．０３１ ５，ｒ＝０．９９９ ９；■熊果酸＝８．５６０×１０－７ｘ－０．０４２ １，ｒ＝０．９９９ ６。在齐墩果酸进样量为２．２４～６．７２ μｇ，熊果酸进样量为２．０３～６．０９ μｇ，进样量与峰面积积分值呈现良好的线性关系。

２）绿原酸标准曲线的绘制。精密吸取绿原酸对照品溶液１．０、３．０、５．０、７．０、１０．０、１５．０ μＬ，进样并记录色谱图，以绿原酸对照品溶液的进样量为纵坐标，峰面积积分值为横坐标进行线性回归，得回归方程■＝５．６４６×１０－７ｘ－０．０９５ ７５，ｒ＝０．９９９ ６。在绿原酸进样量为０．２３２～３．４８０ μｇ，进样量与峰面积积分值呈现良好的线性关系。

３）葡萄糖标准曲线的绘制。取葡萄糖标准溶液０．２０、０．４０、０．６０、０．８０、１．００、１．２０、１．４０ ｍＬ，依次加去离子水至终体积均为２ ｍＬ。另取去离子水２ ｍＬ作空白试验，每支试管加１ ｍＬ ６０ ｇ／Ｌ苯酚溶液，摇匀。用移液管向每支试管中缓慢加入５ ｍＬ浓硫酸，摇匀，放置１５ ｍｉｎ后置于４０ ℃水浴加热１０ ｍｉｎ，取出置于冷水中冷却。在４９０ ｎｍ下测定吸光度，以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程：■＝１２．６４３ｘ－０．０３１，ｒ＝０．９９９ ７。

１．２．５样品中齐墩果酸、熊果酸、绿原酸和多糖含量的测定

１）草苁蓉中齐墩果酸、熊果酸和绿原酸含量的测定。取１０ μＬ经０．２５ μｍ滤膜过滤的草苁蓉提取液，平行进样５次，得色谱图，根据回归方程计算草苁蓉中齐墩果酸、熊果酸和绿原酸的含量。

２）多糖含量的测定。①换算因子的测定。准确称取５．００ ｍｇ草苁蓉多糖，加去离子水定容于２５ ｍＬ容量瓶中。参照葡萄糖标准曲线的绘制方法处理后测定吸光度，按下式计算换算因子：ｆ＝ＣＳ／Ｃ（ＣＳ为多糖的浓度，Ｃ为多糖液中葡萄糖的浓度）。计算得草苁蓉多糖的换算因子为４．８７。②样品溶液的制备。准确称取提取过齐墩果酸、熊果酸和绿原酸的草苁蓉残渣０．５００ ０ ｇ，置于２００ ｍＬ烧杯中，再加去离子水５０ ｍＬ，在水浴锅上加热提取３ ｈ，间歇搅拌，过滤，定容于２５０ ｍＬ容量瓶，取２ ｍＬ，参照葡萄糖标准曲线的绘制方法处理后测定吸光度，根据回归方程求草苁蓉的葡萄糖含量，再根据换算因子求得多糖的含量。

１．２．６稳定性试验取齐墩果酸、熊果酸、绿原酸对照品溶液和多糖溶液，分别在０、１、２、４、８、１２、２４ ｈ后测定齐墩果酸、熊果酸和绿原酸的峰面积积分值及多糖的吸光度，考察齐墩果酸、熊果酸和绿原酸对照品溶液放置后峰面积积分值及多糖吸光度的变化情况。

１．２．７重现性试验精密称取草苁蓉粉末及提取过齐墩果酸、熊果酸和绿原酸的草苁蓉残渣各５份，分别按１．２．２的方法制备待测样品溶液，按１．２．４的方法分析测定，根据１．２．５的方法分别计算齐墩果酸、熊果酸、绿原酸和多糖的含量。

１．２．８回收率与精密度试验为了考察方法的可靠性，分别进行了回收率和精密度的测定。准确称取草苁蓉粉末０．１００ ｇ，准确加入齐墩果酸、熊果酸、绿原酸和多糖各１．０００ ｍｇ，按１．２．２的方法提取制备待测液，按１．２．４的方法分析，计算得回收率和变异系数。

２结果与分析

２．１齐墩果酸、熊果酸和绿原酸检测波长的选择

将齐墩果酸、熊果酸和绿原酸用流动相分别配成待测溶液，用紫外-可见分光光度计于２００～４００ ｎｍ进行光谱扫描，结果表明，齐墩果酸和熊果酸在２１０ ｎｍ处均有较强的吸光度，绿原酸在３２７ ｎｍ处有较强的吸光度。因此，检测齐墩果酸和熊果酸时选择２１０ ｎｍ作为检测波长，检测绿原酸时选择３２７ ｎｍ作为检测波长。

２．２高效液相色谱法流动相的选择

２．２．１检测齐墩果酸和熊果酸的流动相的选择考虑到齐墩果酸和熊果酸均为三萜类化合物，结构非常相似，采用高效液相色谱法也很难将这两种化合物分离开。因此，在选择流动相时进行了系统的研究，分别用体积比为８８∶１２的甲醇、水混合液，体积比为７０∶１０∶２０的乙腈、甲醇、水混合液，体积比为９４∶６的甲醇、１ ｇ／Ｌ乙酸混合液（ｐＨ ３．４）等为流动相，分别进行分析。结果表明，以体积比为９４∶６的甲醇、１ ｇ／Ｌ乙酸混合液（ｐＨ ３．４）作为流动相时，齐墩果酸和熊果酸的分离效果很好。而用其他流动相进行分离时分离效果很不好。因此，选择体积比为９４∶６的甲醇、１ ｇ／Ｌ乙酸混合液（ｐＨ ３．４）作为分析的流动相。

２．２．２检测绿原酸的流动相的选择考虑到绿原酸为苯丙素类化合物，结构较复杂。因此，在选择流动相时用体积比为８８∶１２的甲醇、水混合液，体积比为８８∶１２的乙腈、水混合液，体积比为１０∶９０的乙腈、５ ｇ／Ｌ磷酸混合液等进行试验，结果表明，以体积比为１０∶９０的乙腈、５ ｇ／Ｌ磷酸混合液作为流动相时绿原酸分离效果很好，而其他流动相分离效果则不佳。因此，选择体积比为１０∶９０的乙腈、５ ｇ／Ｌ磷酸混合液作为分析的流动相。

２．３草苁蓉中齐墩果酸、熊果酸和绿原酸的检测结果

取按１．２．１法制得的对照品溶液５ μＬ和按１．２．２法制得的经过０．２５ μｍ滤膜过滤的提取液５ μＬ，按１．２．３色谱条件分别进样分析，平行进样５次，得色谱图，如图１所示。由图１可知，齐墩果酸、熊果酸和绿原酸对照品的保留时间分别是１７．７３７、１８．８９２和１０．７５０ ｍｉｎ，草苁蓉提取液的色谱图中有３个色谱峰，它们的保留时间分别是１７．７０３、１８．８４９和１０．６８０ ｍｉｎ，根据在相同的色谱条件下保留时间相同的色谱峰是相同组分的原理可知，草苁蓉中含有齐墩果酸、熊果酸和绿原酸。

２．４草苁蓉中齐墩果酸、熊果酸、绿原酸和多糖的含量

经过测定得到草苁蓉中齐墩果酸、熊果酸、绿原酸和多糖的含量分别为０．５８６％、０．５７５％、０．３２６％和１１．８３５％。如表１至表4所示。

２．５稳定性试验结果

齐墩果酸、熊果酸和绿原酸的峰面积及多糖的吸光度的变异系数分别为０．４７％、０．２５％、０．５８％和０．１５％，表明它们在２４ ｈ内稳定。

２．６重现性试验结果

齐墩果酸、熊果酸、绿原酸和多糖的变异系数分别为１．６３％、１．７８％、１．５３％和２．７３％，说明重现性较好。

２．７回收率与精密度试验结果

为了考察方法的可靠性，分别进行了回收率和精密度的测定，结果如表１至表４所示。由表１至表４可知，齐墩果酸加标回收率为９６．９０％～９９．８０％，变异系数为１．１３％；熊果酸加标回收率为９７．２０％～１００．３０％，变异系数为１．２６％；绿原酸加标回收率为９７．５０％～１００．２０％，变异系数为１．１０％；多糖加标回收率为９４．３０％～９８．６０％，变异系数为１．７４％。由此可见，该分析结果准确可靠。

３结论

由试验结果可知，草苁蓉中含有较丰富的药物活性很强的齐墩果酸、熊果酸、绿原酸和多糖，其含量分别是０．５８６％、０．５７５％、０．３２６％和１１．８３５％。此数据可为草苁蓉药用价值的进一步科学开发和利用提供理论依据和数据支持。

试验方法操作简单，检测数据准确、可靠，是一种可行性较高的检测方法，可作为草苁蓉中齐墩果酸、熊果酸、绿原酸和多糖的检测方法。

参考文献：

［１］ 常维春，李井山，李树殿． 草苁蓉调查记［Ｊ］．植物杂志，１９９８， １３（５）：２７－３３．

［２］ 李向高，郑友兰．草苁蓉挥发油成分的研究［Ｊ］．中成药，1985， 7（５）：１２５－１３２．

［３］ 李树殿，邱春．长白山草苁蓉化学成分的研究［Ｊ］．中药材，1988，１1（3）：40．

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［５］ 袁珂，李根林，李俊芝．车前草中熊果酸与齐墩果酸的ＨＰＬＣ测定［Ｊ］．中草药，１９９９，30（12）：１１－１３．

［６］ 陈鸿英，马雪梅．泽兰中齐墩果酸和熊果酸的提取、分离［Ｊ］．天津中医药，２００3，20（5）：74．

［７］ 王立新，韩广轩，刘文庸，等．齐墩果酸的化学及药理研究［Ｊ］．药学实践杂志，２００１，２２（２）：４３－４８．

［８］ 郑毅男．草苁蓉化学成分的研究［Ｊ］．吉林农业大学学报，1987， ９（１）：３１．

［９］ 朱晓薇．不同提取方法对二至提取液中总多糖及齐墩果酸的影响［Ｊ］．中成药，199６（６）：２４４－２４６．