木棉花花青素超声波辅助提取工艺的响应面法优化

陈琼 叶思霞

摘要：对提取工艺主要参数进行三因素五水平试验设计，采用响应面试验优化超声波辅助提取木棉花花青素的提取条件。结果表明，超声波辅助提取的最佳工艺条件为提取时间５０ ｍｉｎ，料液比１∶４０（ｍ／Ｖ，ｇ：ｍＬ），超声波功率２１０ Ｗ。

关键词：响应面法；木棉花；花青素；超声波辅助提取

中图分类号：Ｑ９４９．７５７．４；ＴＳ２６４．４ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）16－3575-04

Optimization of Extraction Conditions of Anthocyanins from Bombax malabaricum by Response Surface Methodology

ＣＨＥＮ Ｑｉｏｎｇ，ＹＥ Ｓｉ－ｘｉａ

（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｖｏｃａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０５２０， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｓ ｗｅｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｂｏｍｂａｘ ｍａｌａｂａｒｉｃｕｍ ＤＣ． ｂｙ ｕｌｔｒａｗａｖｅ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄ． Ｔｈｒｅｅ－ｆａｃｔｏｒ ｆｉｖｅ－ｌｅｖｅｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｗａｓ ａｄｏｐｔｅｄ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ， ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｔｉｍｅ， ５０ ｍｉｎ； ｓｏｌｉｄ ｔｏ ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ １∶４０（ｍ/Ｖ，ｇ∶ｍＬ）； ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｐｏｗｅｒ， ２１０ Ｗ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇy； Ｂｏｍｂａｘ ｍａｌａｂａｒｉｃｕｍ ＤＣ．； ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｓ； ｕｌｔｒａｗａｖｅ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ

木棉花为木棉科植物木棉［Ｂｏｍｂａｘ ｍａｌａｂａｒｉｃｕｍ ＤＣ．］的干燥花朵，分布于海南省、台湾省、广西壮族自治区、云南省和四川省南部，在广东省及福建省广为栽培。广东地区群众惯用晒干的木棉花煮粥或者煲汤，其具有解毒、清热、驱寒、去湿、解暑等功效，临床上可用于治疗泄泻、痢疾、血崩、疮毒、中暑等［１，２］。因此，木棉花既是食品又是药品，是极具开发潜力的岭南植物资源，深入开发、充分利用这一特色种质资源对植物资源开发领域有重要的研究意义。

超声波辅助提取技术是利用超声波热学原理、超声波的机械作用和空化作用强化了提取过程的传质速率和效率，与传统的提取法相比，大大缩短了提取时间，提高了提取效率，且提取液中杂质更少，已广泛应用于天然产物的提取中［３］。目前，对木棉花的研究主要集中在木棉花提取物的抗炎、抗菌功效研究［４，５］；在木棉花提取工艺研究方面，叶斯琴等［６］、王辉［７］以木棉花红色素的应用为目标，进行了溶剂提取工艺研究。木棉花中红色素的主要成分是花青素，而花青素在抗炎、调节血脂、改善胰岛素抵抗、抗肿瘤等一系列促进人体健康和预防疾病方面具有生物活性，是一种潜在的医药资源［８］。鉴于此，采用响应面试验优化超声波辅助提取木棉花花青素的工艺条件，旨在为木棉花的深入研究及产业化开发打下基础。

１材料与方法

１.１材料

１．１．１原料木棉花为２０１１年４月采自广东省中药研究所药用植物标本室。

１．１．２试剂ｐＨ １．０缓冲溶液的制备：准确称取１．４９ ｇ ＫＣｌ，用去离子水定容至１００ ｍＬ，将ＫＣｌ溶液与０．２ ｍｏｌ／Ｌ HCl以２６∶６７的体积比混合，用ＫＣｌ溶液调至ｐＨ １．０。ｐＨ ４．５缓冲溶液的制备：准确称取２．７２ g ＮａＡｃ·３Ｈ２Ｏ，用去离子水定容至１００ ｍＬ，调至ｐＨ ４．５。试剂为国产分析纯。

１．1．３仪器与设备ＫＱ－５００ＧＴＤＶ高频恒温数控超声清洗器购自昆山市超声仪器有限公司，冷冻干燥机购自德国Ｃｈｒｉｓｔ公司，旋转蒸发仪购自瑞士步琦有限公司，ＵＶ１２００型紫外分光光度计购自日本日立公司。

１．２方法

１．２．１木棉花的处理方法采摘木棉花后，将其洗净除杂阴干，采用冷冻干燥处理，粉碎过４０目筛，于－２０ ℃保存备用。

１．２．２木棉花花青素最大吸收波长的确定取５ ｇ木棉花干粉，按１∶３０（ｍ／Ｖ，ｇ：ｍＬ）加入含体积分数为１％ HCl的乙醇溶液提取１２ ｈ，间隙式搅拌，过滤滤液后，滤渣再按上述步骤提取一次，合并滤液，旋转蒸发去掉溶剂得到木棉花粗提物，用少量去离子水溶解后，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取，分别得三氯甲烷层、乙酸乙酯层、水层提取物，其中水层提取物为花青素粗提物。一般花青素及其衍生物的特征吸收波长为５２０～５４０ ｎｍ，将木棉花花青素提取物用适量去离子水稀释后，调整至ｐＨ １．０，在５００～６００ ｎｍ波长范围内进行可见光扫描，确定木棉花花青素的最大吸收波长。

１．２．３木棉花提取的响应面试验设计选择提取温度为３０ ℃，选用对花青素提取率影响较大的料液比、超声波功率、提取时间共３个因素，以花青素提取率为指标，采用响应面试验设计来优化提取工艺，各因素与编码水平见表１。

１．２．４木棉花色素的提取及提取率的测定方法取３ ｇ木棉花干粉，按一定料液比加入含体积分数为１％ HCl的乙醇溶液提取１ ｈ后，置于超声波发生装置中进行超声波辅助提取，以６０ ｒ／ｍｉｎ摇床振荡１０ ｍｉｎ后，过滤除滤渣，取上清液测定花青素提取率。

木棉花花青素提取率的测定采用ｐＨ示差法［９，１０］：取５ ｍＬ供试液，分别用ｐＨ １．０和ｐＨ ４．５的缓冲溶液定容至１０ ｍＬ，平衡３０ ｍｉｎ后在最大吸收波长下测吸光度，计算花青素提取率，重复试验３次。花青素提取率＝Ａ／（ε×Ｌ）×ＭＷ×ＤＦ×Ｖ／Ｗｔ×１００％。

其中，Ａ为吸光度；ε为矢车菊素－３－Ｏ－葡萄糖苷的消光系数，为２６９ ００；Ｌ为光程，为１ ｃｍ；ＭＷ为矢车菊素－３－Ｏ－葡萄糖苷的相对分子质量，为４４９．２（注：当样品花色苷单体成分未知时，一般用在植物中最为普遍的花色苷矢车菊素－３－Ｏ－葡萄糖苷作为标准物）；ＤＦ为稀释因子；Ｖ为最终体积，ｍＬ；Ｗｔ为产品质量，ｍｇ；Ａ＝（Ａ５３０ ｎｍ，ｐＨ １．０－Ａ７００ ｎｍ，ｐＨ １．０）－（Ａ５３０ ｎｍ，ｐＨ ４．５－Ａ７００ ｎｍ，ｐＨ ４．５）。

１．２．５数据的分析试验数据用Ｄｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｅｒｔ ８．０软件进行分析。

２结果与分析

２．１木棉花花青素最大吸收波长的确定

一般花青素类物质的特征吸收波长为５２０～５４０ ｎｍ，将木棉花花青素待测液在５００～６００ ｎｍ波长范围内进行可见光扫描，由图１可知，木棉花花青素的最大吸收波长为５２０ ｎｍ。

２．２超声波辅助提取工艺优化模型的建立

２．２．１响应面试验设计与结果采用响应面法对提取工艺参数进行三因素五水平的试验设计，共２０个试验方案，具体方案设计与结果如表２所示。

２．２．２回归方程的建立与检验利用Ｄｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｅｒｔ 8.0软件对表２中数据进行二次多元回归拟合，得到木棉花花青素提取率的预测值对编码因素Ａ、Ｂ和Ｃ的二次多项回归方程：■＝０．３００ ００＋０．０１７ ００Ａ＋０．０１６ ００Ｂ＋０．０１７ ００Ｃ－０．００９ ８８ＡＢ－０．００６ ８８ＡＣ＋０．００５ ６３ＢＣ－０．０１９ ００Ａ２－０．０１０ ００Ｂ２－０．００９ ２２Ｃ２，R=0.906 0。

由表３的方差分析可知，回归方程的失拟性检验不显著，可以认为所选用的二次回归模型是适当的；回归模型的决定系数为０．９０６ 0，说明该模型能够解释９０．６％的变化，因此可用此模型对木棉花花青素提取率进行分析和预测，对实践具有指导意义。

２．２．３各因素影响程度和因素间交互作用分析由方差分析结果可知，试验所建立的回归模型中，超声波功率、提取时间、料液比对木棉花花青素提取率均有显著影响（Ｐ＜０．０５），而三因素两两之间的交互作用不显著。超声波功率、提取时间的二次项对花青素提取率有显著影响，而料液比的二次项时花青素提取率有极显著影响。根据二次回归方程得到参数和响应值之间的响应曲面及等高线如图２、图３和图４所示。

图２中等高线的形状反映出超声波功率和料液比的交互效应，在试验水平范围内，超声波功率增大，花青素提取率呈增大趋势。在其他因素不变的前提下，料液比减小，花青素提取率随之增大，到达最高值后反而降低。要达到同样的花青素提取率，料液比越大，所需要的超声波功率越大。在试验水平范围内，花青素的提取率存在极大值。

由图３的提取时间和料液比的交互效应可知，提取时间的增大有利于花青素的溶出，提取率呈增大趋势。在其他因素不变的前提下，料液比减小，花青素提取率随之增大，到达最高值后反而降低。原因可能是由于料液比的减小使分离效率降低，而过高的超声波功率或过长的提取时间会导致花青素的分解，造成损失。因此，当料液比、提取时间和超声波功率合理搭配时才能获得较好的提取效果。

由图４可知，在试验水平范围内，随着超声波功率或提取时间的增大，花青素提取率呈增大趋势。因此，适当加大超声波功率和提取时间能提高花青素的提取率，但当超声波功率和提取时间超过一定值，花青素提取率增加不明显。

２．２．４工艺参数的优化与验证经过软件分析，最佳的提取条件为：料液比１∶４０（ｍ／Ｖ，ｇ∶ｍＬ，下同），超声波功率２１０ Ｗ，提取时间５０ ｍｉｎ。按最佳提取条件进行３次验证试验，测得花青素提取率为０．３１６％，与理论值接近，相对误差为０．８１％。证明该模型适用于预测该工艺，重现性好。

３小结与讨论

采用响应面分析法，通过中心组合试验直观地分析多种因素之间的交互作用，并能在试验设计的整个区域范围内找到考察因素的最佳细化值。而常用的正交设计法只能在试验所选取的因素与水平内进行选择。

试验曾对乙醇体积分数、提取温度、超声波功率、提取时间、料液比等单因素进行考察，结果发现，由于木棉花色素主要是花青素，乙醇体积分数增大有利于木棉花色素的提取，而且加入少量HCl有利于提高花青素的稳定性，但HCl体积分数较大时，浓缩蒸发会降解花青素，不利于提取，因此选用含体积分数为１％ HCl的乙醇溶液作为提取溶剂。而高温和光照对花青素破坏较大，因此，提取过程适宜在室温下避光进行。最终确定超声波功率、提取时间和料液比作为响应面设计试验的考察因素。

试验采用响应面分析法进行木棉花花青素提取工艺的研究，确定超声波辅助提取的最佳工艺条件为料液比１∶４０，超声波功率２１０ Ｗ，提取时间５０ ｍｉｎ。该工艺的提取率高、操作简便，为木棉花中色素的提取提供了试验依据。

参考文献：

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［８］ ＫＯＷＡＬＣＡＹＫ Ｅ， ＫＲＺＥＳＩＮＳＫＩ Ｐ， ＫＵＲＡ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｓ ｉｎ ｍｅｄｉｃｉｎｅ［Ｊ］． Ｐｏｌ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００３，５５（５）：６９９－７０２．

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