真鳕鱼骨明胶的提取工艺及性质研究*

王珊珊，单银银，李志皓，乔若瑾，李八方

(中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛，266003)

真鳕鱼骨明胶的提取工艺及性质研究*

王珊珊，单银银，李志皓，乔若瑾，李八方

(中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛，266003)

以真鳕鱼骨为原料对其明胶的提取工艺进行了研究。在单因素实验基础上，通过正交实验探讨HCl浓度、酸处理时间、提取温度和提取时间对鱼骨明胶得率的影响。结果表明:HCl浓度4%，酸处理时间18 h，提取温度70℃，提取时间8 h，明胶提取率最高，达98.02%。明胶在235 nm处有最大吸收。在上述提取条件下，得到的明胶经红外光谱检测失去三螺旋结构，在扫描电镜观察下明胶具有多孔的网状结构。

真鳕鱼骨，明胶，提取，得率

明胶是一种重要的高分子蛋白质，含有除色氨酸之外的所有必需氨基酸。明胶是用动物(主要是猪和牛等)的结缔组织(如皮、骨、筋腱、韧带等富含胶原的组织)经酸法或碱法预处理后抽提制成。明胶因具有独特的理化性质和较好的生物相容性，因而被广泛应用于食品、医药、化妆品、照相材料等领域，近年来全球对明胶的需求量持续增长。随着疯牛病和口蹄疫等人畜共患疾病的出现，传统明胶的安全性受到广泛质疑。水产来源的明胶不仅具有更好的安全性，还可迎合部分地区的宗教需求，有利于水产加工副产物(鱼皮和鱼骨)的高值化利用，具有广阔的市场前景。

目前水产来源明胶原料主要是鱼皮[1-3］，而使用鱼骨提取明胶的研究还较少。太平洋真鳕(Gadus macrocephalus)是重要的商业捕捞鱼种，目前我国对真鳕的加工主要集中在利用其鱼肉进行鳕鱼鱼片的生产，产生的废弃物如皮、骨等尽管具有较高的营养价值，但仅有一部分用于小食品和低值鱼粉的生产。因此，从水产加工副产物鱼骨中提取明胶，既能增加产品的附加值，同时可以扩大明胶的原料选择，减少资源的浪费。本实验着重研究从太平洋真鳕鱼骨中提取明胶的最佳工艺及明胶的主要性质，为实现鱼骨明胶的产业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

太平洋真鳕(Gadus macrocephalus)鱼骨取自青岛福生食品有限公司，真鳕来源于白令海。原料获取后去除杂质，冷藏于-18℃冰箱中备用。

乙二胺四乙酸二钠、HCl、氯胺T、对二甲氨基甲醛等试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司出品。

1.1.2 仪器与设备

电热恒温水浴锅(HHS-Ni)，北京长安科学仪器厂制造;冷冻干燥机(Alpha 1-4 LD型)，德国CHRIST公司制造;紫外分光光度计(UV-2102PC型)，尤尼柯(上海)仪器有限公司制造;傅立叶红外光谱仪(Nicoletnexos型)，美国Nicolet公司制造;扫描电子显微镜(JSM-840)，日本JEOL公司出品。

1.2 实验方法

1.2.1 基本成分测定

水分测定:恒温干燥法(GB/T 5009.3-2003);蛋白质测定:凯氏定氮法(GB/T 5009.5-2003);脂肪测定:乙醚抽提法(GB/T 5009.6-2003);灰分的测定:灰化法(GB/T 5009.4-2003);羟脯氨酸测定:依照ISO3496:1978(E)[4］方法进行测定。

1.2.2 鱼骨明胶提取

1.2.2.1 明胶提取的工艺流程

冷冻鱼骨→清洗，去杂质→NaOH溶液处理→水洗至中性→EDTA溶液处理→盐酸处理→水洗至中性→匀浆→提胶→离心→真空浓缩→冷冻干燥→成品明胶

1.2.2.2 明胶提取率

式中:T，明胶提取率，%;A，提取明胶中的羟脯氨酸含量，g;B，原料中羟脯氨酸的含量，g。

1.2.2.3 单因素实验

太平洋真鳕鱼骨明胶单因素实验的基本条件设定为:HCl质量分数为4%，酸处理时间为12 h，提取温度为50℃，提取时间为6 h，提胶料液比为1∶10。改变其中一个条件，固定其他条件以分析HCl质量分数、酸处理时间、提取温度、提取时间及提胶料液比对明胶得率的影响。实验重复3次，结果取平均值。

1.2.2.4 正交实验设计

根据单因素实验结果，以明胶得率为指标，对酸质量分数、酸处理时间、提取温度和提取时间4个因素设计正交实验L9(34)。实验重复3次，结果取平均值，对实验结果进行统计分析，优化提取工艺。

1.2.3 明胶的紫外光谱扫描

将提取得到的明胶样品溶解于0.5 mol/L醋酸溶液中，配制成1 mg/mL的明胶溶液，使用UV-2550紫外分光光度计在200～400 nm近紫外光区以120 nm/min的速度进行扫描。

1.2.4 傅立叶红外光谱(FTIR)分析

在干燥条件下，将适量样品和KBr在玛瑙研钵中充分研磨混匀。取样品手动压片，将样品放入样品室，使用Nicolet-200SXV傅立叶红外光谱仪对样品在4000～500 cm-1区间扫描，分辨率设置为2 cm-1。

1.2.5 扫描电镜观察

取冷冻干燥样品固定后真空喷金处理，加速电压为20 kV，以JSM-840型扫描电子显微镜观察样品的显微结构。

2 结果与分析

2.1 鳕鱼骨基本成分测定

本实验所测得的真鳕鱼骨基本组成成分见表1。

表1 鳕鱼骨基本组成成分

该鱼骨中粗蛋白含量17.3%，灰分14.7%，水分含量64.2%，脂肪含量1.2%，羟脯氨酸含量1.2%。羟脯氨酸是胶原蛋白的特征氨基酸，通过测定羟脯氨酸的浓度可以得到胶原蛋白的大致含量。一般对水生动物换算系数通常采用11.1[5］，得出鳕鱼骨中的胶原蛋白含量约为13.3%，约占总蛋白的77%。因此，鱼骨可作为一种较好的明胶提取原料。

2.2 酸质量分数对明胶得率的影响

经EDTA溶液脱钙处理后，鱼骨色泽洁白，感官评价较软。直接对脱钙后的鱼骨进行热水抽提明胶得率极低，这是因为脱钙鱼骨组织结构紧密，单纯的热处理无法有效破坏组织中胶原蛋白的氢键和共价键，胶原难以转化成明胶被提取出来。因此，首先需用酸溶液对原料进行溶胀处理。酸处理可以打开胶原端肽区的交联、胶原三螺旋结构的酰胺键以及胶原分子内和分子间的氢键、共价键和非共价键，从而使原料溶胀进而提高热水抽提的提取率[6］。

图1 酸质量分数对明胶提取率的影响

实验分析了酸质量分数在1%～5%内对明胶提取率的影响。实验结果如图1所示，HCl浓度在小于2%时，明胶得率增加缓慢。这是因为在原料中，胶原在分子内、分子间以及端肽区具有大量由氢键、共价键和非共价键所形成的交联[6］，低浓度的酸溶液无法有效打开这些交联;当浓度大于2%时，胶原分子内和分子间的离子交联和氢键交联被充分打开，热水处理时水分子能轻易进入胶原分子链的间隙，有效促进了热力对氢键和非共价键的断裂，从而提高显著明胶得率。在酸质量分数为4%时明胶得率达到高值;但当酸浓度继续增加时明胶的提取率会有所下降，这可能是因为浓度过大反而会致使酸溶性的胶原在处理过程中溶解到酸溶液中或被直接酸解。因此酸质量分数在3.5%左右较为合适。

2.3 酸处理时间对明胶得率的影响

实验分析了4～20 h内不同酸处理时间对明胶提取率的影响。从图2中可以看出，酸处理时间在16 h以内时，明胶的得率一直在显著上升。这是因为脱钙后的原料虽然变软，但结构仍较为致密，酸溶液需要一定的时间对其进行溶胀;当酸处理时间达到16h时，酸溶液对胶原分子的溶胀较为充分，明胶提取率达到最高;但当酸处理时间进一步提高时，得率却再无显著变化。继续进行酸处理，酸对胶原的溶胀作用已经结束，而胶原分子可能会由于过长时间的酸处理而被部分降解成分子质量更小的肽链，溶解在酸溶液中进而造成胶原的损失。因此，酸处理的理想时间为16 h为宜。

图2 酸处理时间对明胶提取率的影响

2.4 提取温度对明胶得率的影响

实验分析了在40～80℃内提取温度对明胶提取率的影响，实验结果如图3所示。当原料经充分溶胀后，加热可以有效断裂胶原分子端肽区域及三螺旋结构区域的次级键，使胶原溶出转变为明胶。由图3可以看出，明胶的得率随温度的升高而升高，温度达到70℃时明胶提取率高达94.3%;当提取温度进一步升高时，明胶得率增加不显著。提高提取温度可大大缩减提取时间并提高明胶得率，但相应会加速明胶的次级水解，使明胶的黏度和凝胶强度下降[7］。由此可见，鱼骨明胶提取温度为70℃较为合适。

图3 提取温度对明胶提取率的影响

2.5 提取时间对明胶得率的影响

图4 表明，明胶提取率随着提取时间的增加而明显提高，当时间达到8 h时明胶得率达到57.8%。当提取时间继续增加时，明胶得率变化不大。热水抽提时间过短，明胶无法充分提取出来，得率太低;时间过长则会使明胶过度水解[8］，降低明胶的理化性质。因此，鱼骨明胶较合适的提取时间为8 h为宜。

2.6 提胶料液比对明胶得率的影响

料液比是影响明胶提取率的因素之一，合适的料液比可以使原料中的明胶得到充分提取。由图5可知，明胶得率在料液比1∶6时达到最高。料液比较低时，由于体系内溶剂含量少，不利于原料在溶剂中得到充分震荡，得率较低。当料液比超过1∶6时，其提取效率增加幅度不大，也会增加后续离心、浓缩等工艺步骤的工作量。因此，料液比选为1∶6比较合适。

图4 提取时间对明胶提取率的影响

图5 提胶料液比对明胶提取率的影响

2.7 鱼骨明胶最优提取条件的选择

表2 鱼骨明胶提取正交实验结果

在提取鱼骨明胶时，既要尽可能提高产品得率，同时还要降低提取成本。采用正交实验对提取条件进行优化，结果见表2。由极差R值可以看出，各因素对明胶得率的影响大小为提取温度＞酸质量分数＞酸处理时间＞提取时间。因此，提取温度对明胶得率的影响最为显著。明胶得率极差分析最佳组合为A2B3C3D3，即酸质量分数4%，酸处理时间18 h，提取温度70℃，提取时间8 h。在此优化条件下，明胶提取率为98.02%。

2.8 鱼骨明胶部分性质研究

2.8.1 鱼骨明胶基本成分测定

真鳕鱼骨在最佳工艺条件下通过离心、浓缩、冷冻干燥后可以得到纯度较高、色泽洁白、无异味的鱼骨明胶。由表3可见，鱼骨明胶蛋白质含量大约94.1%，羟脯氨酸含量约7.5%，明胶纯度达到90.4%。

表3 鱼骨明胶基本组成成分

2.8.2 紫外光谱分析

蛋白质分子中含有能吸收一定紫外波长光的紫外生色基团，例如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基酸在280 nm处有较强的紫外吸收，各种紫外生色基团的加和使得蛋白质溶液在紫外区存在一定的吸收[9］。由图6可见，鱼骨明胶的最大吸收波长约在235 nm处，这是明胶的特征吸收峰，主要是电子的N→л*和N→σ*跃迁所产生。鱼骨明胶在280 nm处吸收较少，说明样品只含有少量芳香族氨基酸，可以初步判断所提取的明胶具有较高的纯度。

2.8.3 傅立叶红外光谱(FTIR)分析

傅立叶红外光谱可用来研究胶原蛋白和明胶二级结构的变化。在红外光谱中可以表示蛋白质二级结构变化的区域主要是酰胺A[10］，酰胺I(1636～1661 cm-1)，酰胺II(1549～1558 cm-1)[11］和酰胺III(1200～1300cm-1)[12］。其中，酰胺I带是蛋白质多肽骨架CO伸缩振动产生，是研究蛋白质二级结构变化的最有效区域[13］。由图7可见，与酸法[14］提取的未变性酸溶性胶原蛋白(B)相比，热水抽提明胶(A)的酰胺A吸收峰变宽，而酰胺I(1648.46 cm-1)、II(1540.64 cm-1)、III(1237.83 cm-1)峰值强度明显减少。这些变化表示，明胶分子失去了三螺旋结构而转变为无序状态[12］。

图6 鱼骨明胶的紫外吸收光谱

图7 骨明胶的傅立叶红外(FTIR)光谱图

2.8.4 扫描电镜观察

图8 鱼骨明胶的扫描电镜(SEM)图

如图8所示，在扫描电镜下鱼骨明胶具有细小连续孔的网状结构，这些孔径的大小与制备明胶过程中水分含量的多少有关。这种有序的多孔海绵状结构可以有效容纳固体及液体微粒。因此，通过调节孔径的大小，明胶能够作为药物的新型载体在医学领域得到广泛的开发和应用[15］。

3 结论

在单因素实验的基础上采用正交实验确定了真鳕鱼骨提取明胶的最佳条件:HCl质量分数4%，酸处理时间18 h，提取温度70℃，提取时间8 h，明胶提取率可达98.02%。经过离心、浓缩、干燥后得到白色、无异味的鱼骨明胶，其纯度达到90.4%。经紫外光谱扫描，明胶在235 nm处有最大吸收，在280 nm处吸收较少。红外光谱检测发现明胶失去三螺旋结构。在扫描电镜观察下明胶具有多孔的网状结构。

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ABSTRACTAquatic gelatin was prepared from the bone of Pacific cod.The influences of different extraction parameters，including concentration of hydrochloric acid，acid soaking time，extraction temperature and time on the extraction rate of bone gelatin were investigated.On the base of single-factor experiment，the optimum parameters of extraction for bone gelatin were obtained by orthogonal experiment as follows:the concentration of hydrochloric acid 4%，acid soaking time 18h，the extraction temperature 70℃and time 8h，the yield was 98.02%.Gelatin exhibited the maximum absorbance at 235nm.FTIR spectra showed the significant loss of molecular order of triple helix.The gelatin displayed a polyporous network under SEM.

Key wordscod bone，gelatin，extraction，yield

Study on the Extraction and Property of Gelatin from Pacific Cod Bone

Wang Shan-shan，Shan Yin-yin，Li Zhi-hao，Qiao Ruo-jin，Li Ba-fang
(College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China)

博士研究生(李八方教授为通讯作者，Email:bfli@ouc.edu.cn。)。

*国家自然科学基金(30871943)狭鳕鱼皮胶原蛋白分子结构与物理及其耦合性的研究

2011-10-10，改回日期:2011-12-12