蜂王浆醇溶性成分分析及其抗氧化性研究

陈波，徐德平

(江南大学食品学院，江苏无锡，214122)

蜂王浆醇溶性成分分析及其抗氧化性研究

陈波，徐德平

(江南大学食品学院，江苏无锡，214122)

蜂王浆经体积分数95%乙醇提取、MCI-Gel、ODS等反相色谱柱分离，得到单磷酸腺苷(AMP)和7种脂肪酸。采用1，1-二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·)清除率和总抗氧化能力试剂盒(T-AOC)等方法探索蜂王浆醇溶性物质的抗氧化能力，结果表明:蜂王浆醇提后抗氧化活性提高，分离得到的AMP和3，10-二羟基癸酸(3，10-DDA)的抗氧化性相对较强，且清除DPPH·的IC50值分别为6.274 mg/mL和9.153 mg/mL，是蜂王浆中的抗氧化活性物质。

蜂王浆，分离，结构鉴定，抗氧化

蜂王浆(royal jelly，RJ)是5～15日龄的工蜂舌腺和上腭腺分泌的一种浆状物质，呈乳白色或淡黄色，有酸涩味，是蜂王幼虫整个发育期和雄蜂幼虫前期的唯一食物。蜂王浆除含有大量的蛋白质(占干物质的36%～55%)、糖类(20%以上)外，还有包括10-HDA在内的许多活性物质[1］。蜂王浆具有增强机体免疫力，延缓衰老，抗肿瘤，抗菌消炎等生理活性，广泛应用于医药、化妆品、保健食品[2］。

目前关于蜂王浆抗氧化能力的研究主要集中在蜂王浆抗氧化活性肽[3］和超氧化物歧化酶 SOD[4］上，对蜂王浆中蛋白质和肽以外的其他物质的抗氧化性研究较少。本研究用高浓度乙醇沉淀了蜂王浆中绝大部分蛋白，对得到的蜂王浆醇溶性物质进行了分离及结构鉴定，并研究了各组分及单一成分的抗氧化能力，旨在发现蜂王浆的其他抗氧化活性物质。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

蜂王浆，购于南京老山药业有限公司;GF254硅胶板，由山东烟台芝罘化工厂生产;总抗氧化能力(TAOC)试剂盒，南京建成生物科技有限公司生产;1，1-二苯基-2-苦基苯肼自由基(DPPH·)，Sigma公司提供;其他试剂皆为分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司生产。

1.2 仪器和设备

旋转蒸发器 RE52CS，上海亚荣生化仪器厂;暗箱式紫外透射仪ZF-90，上海顾村电光仪器厂;HL-2恒流泵，上海沪西分析仪器厂有限公司;Brucker AVance500核磁共振仪、LCQ型质谱仪，Thermo-Finnegan公司;TU-1900型双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司;循环水多用真空泵(SHB-III)，郑州长城科贸有限公司;HH-4数显恒温水浴锅，江苏省金坛市荣华仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 蜂王浆中醇溶性物质提取

蜂王浆10 kg，组织捣碎机捣碎，以体积分数95%乙醇为溶剂，料液比1∶4(g∶mL)，40℃提取3h，3000 r/min离心30 min，将沉淀物按上述方法重复提取2次，合并3次提取液，减压回转蒸发浓缩，得到蜂王浆醇提物(ethanol extracts of royal jelly，ERJ)。另将蜂王浆乙醇提取后沉淀物(precipitate from royal jelly，PRJ)浓缩至干，备用。

1.3.2 蜂王浆醇提物的分离

ERJ浓缩后过MCI-Gel柱(6 cm×100 cm)，流速15 mL/min，依次用去离子水、体积分数10%、30%、50%、70%、95%乙醇溶液梯度洗脱，洗出液用锥形瓶收集。TLC薄层层析法跟踪检测洗脱液，根据Rf值将洗脱液粗分为水洗脱部分(A)、10%乙醇洗脱部分(B)、30%乙醇洗脱部分(C)、50%和70%乙醇洗脱部分(D)4个部分，95%乙醇洗脱部分由于固形物量少不做研究。减压浓缩A、B、C、D 4部分，每部分取少量干燥备用。

1.3.3 MCI-Gel柱分离后各组分的成分分离与鉴定

将A、B、C、D 4个部分分别反复上 ODS-AQ(3 cm×100 cm)、ODS-A(3 cm×100 cm)、ODS-B(3 cm×100 cm)等色谱柱分离，用乙醇溶剂梯度洗脱，收集洗脱液，15 mL/管自动收集，采用TLC薄层法检测，最终得到8种化合物。以二甲基亚砜为溶剂，四甲基硅烷(TMS)为内标物，化合物经氢谱(1H-NMR)和碳谱(13C-NMR)等光谱数据分析，确定其化学结构。

1.3.4 抗氧化活性实验

1.3.4.1 清除DPPH·自由基能力

准确称取7.8 mg DPPH·，用无水乙醇定容于100 mL容量瓶中，得到0.2 mmol/L DPPH·溶液。将待测样品冷冻干燥，分别制成 1、3、5、10、15 mg/mL等浓度溶液备用。参考Sun等人[5］的方法进行测定:分别取待测样品和对照物各2 mL，各加入2 mL 0.2 mmol/L的 DPPH溶液，充分混匀，避光反应30 min后在517 nm处测吸光度(Ai);同时，取各待测样品2 mL，分别加入2 mL无水乙醇，充分混匀，测其在517 nm处的吸光度(Aj);测定空白对照在517 nm处的吸光度(Ac)。每个样品3次重复，取平均值。

1.3.4.2 总抗氧化能力(T-AOC)

配制10 mg/mL试样，按照T-AOC试剂盒说明进行操作，在520 nm处测吸光度。试验重复3次，取平均值。本实验以样品管与对照管在520 nm处的吸光度的差值(ΔA520)大小来反应其总抗氧化能力，差值越大，总抗氧化能力越强。

2 结果与讨论

2.1 蜂王浆中不同组分的抗氧化活性

2.1.1 蜂王浆提取物对DPPH·清除率的测定

DPPH·是一种稳定的自由基，在517 nm处有强吸收。当有自由基消除剂存在时，DPPH·的单电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度变小，且这种颜色变浅的程度与配对电子数是成化学计量关系的[6］。因此通过检测517 nm处吸光度的变化，可以反映其消除自由基的能力，而能力的大小用抑制率表示。蜂王浆中不同组分的DPPH·清除能力如图1所示。

蜂王浆醇提物(ERJ)清除DPPH·能力提高，而醇提后沉淀物(PRJ)的DPPH·清除率较低，表明蜂王浆中具有清除DPPH·能力的物质主要存在于ERJ中。ERJ经MCI-Gel柱分离后，水洗脱部分(A)和10%乙醇洗脱部分(B)的DPPH·清除率高于ERJ，分别达到了68.9%和50.1%，C、D清除率比ERJ低。

图1 蜂王浆中不同组分清除DPPH·能力

2.1.2 蜂王浆提取物总抗氧化能力(T-AOC)的测定

对总抗氧化能力的测定时利用抗氧化物质能使Fe3+还原成Fe2+，Fe2+可与菲林类物质形成稳定的络合物的性质，通过比色法可以测定样品抗氧化能力的强弱。测定管与对照管吸光度差值越大，抗氧化能力越强。考察各蜂王浆提取物在相同浓度下的总抗氧化能力，结果见图2。

图2 蜂王浆中不同组分总抗氧化能力

由图2可知，相同浓度下，各组分的总抗氧化能力强弱顺序依次为:B＞A＞ERJ＞RJ＞C＞D＞PRJ。这与清除DPPH·能力相一致，表明蜂王浆中抗氧化活性物质溶于乙醇，且主要集中在组分A、B中。

2.2 MCI-Gel柱分离后各组分的成分

将 ERJ经 MCI-Gel柱分离，得到 A、B、C、D4个组分，各组分再经ODS-AQ、ODS-B等反相色谱柱柱分离，得到8种化合物，结果见表1。

由表1，从A、B、C、D中分别分离得到2种化合物，其中化合物2～8为脂肪酸。通过TLC法检测，得知这8种化合物的Rf值依次增大，说明化合物1～8的极性是逐渐变小的。其中，A中分离出的化合物1(AMP)是生物体代谢的能量源泉，是参与遗传信息贮存、遗传与表达的核酸构件，RJ中含量在5.9～2057.4 mg/kg[7］;化合物 6，又称王浆酸，目前只发现在蜂王浆中存在，占新鲜蜂王浆的1.4%～2.0%，是蜂王浆中的标志性物质[8］。化合物 2、5、6、7、8 是 RJ中的短链脂肪酸，这些脂肪酸是RJ中一组特殊的C10羟基脂肪酸[9］，Dragana Vucevic等曾报道 RJ中的短链脂肪酸对机体具有免疫调节作用[10］。

表1 ERJ色谱柱柱分离结果

2.3 蜂王浆醇溶性物质中各单一成分的抗氧化活性分析

由于分离得到的化合物在含量上有较大差异，有些化合物量较少无法进行活性试验，所以本研究对磷酸腺苷、3，10-2-羟基癸酸(3，10-DDA)、王浆酸(10-HDA)、10-羟基癸酸(10-HDAA)、9-羟基癸酸(9-HDAA)、8-羟基癸酸(8-HDAA)等6种物质进行了抗氧化活性的分析。

2.3.1 蜂王浆醇溶性物质中单一成分清除DPPH·自由基能力的测定

对蜂王浆醇溶性物质中分离得到的6种物质进行清除DPPH·能力的测定。结果见图3。

图3 蜂王浆醇溶物中各成分清除DPPH·能力

由图3可见，每种物质对DPPH·均具有一定的清除能力，且随着各物质的浓度增加，对DPPH·的清除能力也逐渐增加，具有良好的剂量效应关系。在浓度15 mg/mL时，10-HDAA、9-HDAA、8-HDAA 等的DPPH·清除率较低，均未达到30%，而AMP和3，10-HDAA在15 mg/mL时清除率分别达到了89.1%和78.3%。经计算，AMP的IC50值为6.274 mg/mL，3，10-DDA 的 IC50值为9.153 mg/mL。

2.3.2 总抗氧化能力(T-AOC)

对蜂王浆醇溶性物质中分离得到的6种物质进行总抗氧化能力的测定。结果见图4。

图4 蜂王浆醇溶性中各组分总抗氧化能力

由图4可知，AMP和3，10-DDA的总抗氧化能力很高，比较图2分别约是RJ抗氧化能力的3.4倍和6.5倍。另外，由于A的总抗氧化能力比B强，而A中分离出来的AMP的总抗氧化能力比B中的3，10-DDA弱，有理由相信A中有其他高抗氧化活性物质存在，可能是小分子物质BHT[11］或者一些酚类物质[12］，需要作进一步研究。10-HDA虽然是蜂王浆的标志物质，具有生物活性，但其抗氧化能力比较弱，这与Yoshimi等的研究结果一致[13］。

3 结论

蜂王浆经体积分数95%乙醇提取所得的醇溶性成分抗氧化活性比原浆强，而醇提后的沉淀物抗氧化活性很低。经MCI-Gel、ODS等反相色谱柱分离，发现醇溶性物质中含有 AMP、3，10-DDA、10-HDA、10-HDAA、9-HDAA、8-HDAA等成分。研究发现，提取物中极性较小的短链脂肪酸的抗氧化活性较弱，王浆酸的抗氧化能力不高，而AMP、3，10-DDA具有强的抗氧化活性，其清除 DPPH·的 IC50值分别是6.274 mg/mL和9.153 mg/mL，是蜂王浆中的抗氧化活性物质。除此以外，蜂王浆中肯定还有其他抗氧化物质存在，需要作进一步研究。

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ABSTRACTAfter royal jelly(RJ)was extracted with 95%ethanol and isolated with chromatographic columns MCI-Gel and ODS，adenosine monophosphate and 7 kinds of fatty acids were obtained.The scavenging free radicals(DPPH·)of 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl and the total antioxidant capacity kit(T-AOC)were used to study antioxidation of alcohol soluble components.The results showed that antioxidation of royal jelly improved after extraction and the antioxidant activity of AMP and 3，10-dihydroxydecanoic acid(3，10-DDA)were relatively higher，IC50value for DPPH· scavenging activity were 6.274 mg/mL and 9.153 mg/mL respectively.They were identified as the Antioxidants in royal jelly.

Key wordsroyal jelly，isolation，structural determination，antioxidation

Structure and Antioxidation Studies of Alcohol Soluble Components in Royal Jelly

Chen Bo，Xu De-ping
(School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

硕士研究生(徐德平副教授为通讯作者，E-mail:xdp1219@sina.com)。

2012-06-05，改回日期:2012-06-26