维药材小檗果提取物的体外抑菌实验研究

田 莉，杨 建，田树革，乌莉娅·沙衣提，吴玲玲

（1.新疆医科大学中医学院，新疆乌鲁木齐 830011；2.新疆名医名方与特色方剂学重点实验室，新疆乌鲁木齐830011；3.新疆医科大学药学院，新疆乌鲁木齐 830011）

维药材小檗果提取物的体外抑菌实验研究

田 莉1，2，杨 建3，田树革2，*，乌莉娅·沙衣提1，吴玲玲1

（1.新疆医科大学中医学院，新疆乌鲁木齐 830011；2.新疆名医名方与特色方剂学重点实验室，新疆乌鲁木齐830011；3.新疆医科大学药学院，新疆乌鲁木齐 830011）

观察小檗果不同极性提取物的体外抑菌活性。采用微孔板法和对倍稀释法研究小檗果不同极性提取物对变异链球菌和大肠杆菌生长及其生物膜形成的影响。结果显示，乙醇、水、乙酸乙酯和正丁醇提取物对变异链球菌生物膜的形成有一定抑制作用，其中乙醇和水提取物抑制作用很强；乙酸乙酯提取物对大肠杆菌的生长有一定抑制作用，正丁醇、乙酸乙酯、氯仿提取物对大肠杆菌生物膜的形成有一定抑制作用，其中氯仿提取物的抑制活性最强。小檗果含有有效抑制供试菌生长及其生物膜形成的活性成分，值得进一步研究开发。

小檗果，体外抑菌，生物膜，两倍稀释法

Abstract：To study the antibacterial activity of the extracts with different solvent from Fructus berberis.Microwell plate method and double dilution method were used to determine the minimum inhibitory concentration（MIC） of the extracts of Fructus berberis against streptococcus mutans and Escherichia coli.The results showed that the ethanol extrac，water extract，ethyl acetate extract and n-butanol extract could inhibit the formation of biofilm of stretopcoccus mutans.The ethyl acetate extract had certain inhibition on the growth of Escherichia coli.The n-butanol extract，ethyl acetate extract and chloroform extract could inhibit the formation of biofilm of Escherichia coli，especially chloroform extract showed the obviously antibacterial activity.Fructus berberis had obvious antibacterial activity composition and were worth further studying.

Key words：Fructus berberis；antibacterial effect in vitro；biofilm；double dilution method

红果小檗（Berberis nummularia Bge.）系小檗科植物，是新疆及中亚地区特有的药食兼用植物，目前，主要分布于伊犁河流域，在东至巩留、特克斯县，西至霍城县一带有大量自然茂密生长的红果小檗资源，其果实属浆果，是维吾尔族人民喜食的野果之一，其富含维生素、糖类及人体必需的微量元素等营养成分，可以加工成各种果酱和果汁饮料[1-2]。红果小檗是维吾尔医药的一种常用药材，其根、根皮、茎及果实均可入药，小檗果即为其干燥成熟的果实，于秋季采摘，晒干，已收载于《中华人民共和国卫生部标准》（维吾尔药分册），具健胃和中，生律止渴，清热解毒等功能，维医临床用于治疗消化不良，痢疾泻下，口渴，口疮，咽炎等症[3-4]。对红果小檗中生物碱的提取和检测方法研究已有文献报道[5]，但药效研究未见报道。新疆红果小檗分布面积广，资源丰富，尚未得到有效开发利用，极具研究价值。本文采用微孔板法和对倍稀释法进行了小檗果体外抑菌的初步研究，为综合开发利用新疆红果小檗资源奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小檗果 购于新疆维吾尔自治区维吾尔医院，经新疆医科大学中医学院乌莉娅·沙衣提教授鉴定为红果小檗的干燥果实；变异链球菌（Streptococcus mutans，ATCC 700610）、大肠杆菌（Escherichia coli，ATCC 35218） 均购于中国药品生物制品检定所；脑心浸液培养基（Brain Heart Infusion Broth，BHI）、营养肉汤培养基（Nutrient Broth，NB） 均购于美国BD公司；结晶紫 购于上海研晶生物科技有限公司，去氧胆酸钠（Sodium deoxycholate，SD） 购于Sigma-Aldrich公司；其余化学试剂 均为分析纯；实验用水蒸馏水。

表1 小檗果不同溶剂提取物对变异链球菌生长的抑制率（%，Mean±SD，n=4）Table 1 The inhibition rate of different solvent extracts from Fructus berberis on the growth of Streptococcus mutans（%，Mean±SD，n=4）

SPECTRAMAX 190酶标仪 美国Molecu1ar Devices公司；YJ-875A医用净化工作台 苏州金燕净化设备厂；DNP-9162型电热恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司；3110系列CO2培养箱 美国赛默飞世尔科技公司；YXQ-LS-SI全自动立式电热压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业医疗设备厂；冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；电子天平 德国赛多利斯公司；RE-52A旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 小檗果提取物的制备 称取干燥小檗果粗粉200g，过10目筛，用石油醚1.5L回流提取1.5h后，滤过，滤渣依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇和水1.5L回流提取2h后滤过，均重复提取三次，滤液分别置于旋转蒸发仪中浓缩减压后得稠浸膏，再经冷冻干燥成粉末，均密封冷藏备用。

1.2.2 菌种复苏与培养 将变异链球菌、大肠杆菌标准菌种分别置于装有2mL培养基的有盖试管中，置于37℃ 5%CO2培养箱内培养16h后，经比浊法判断试管变浑浊，说明菌种已复苏。

把灭过菌的培养皿和培养基倒平板，冷却凝固后，用接种针挑取少许待复苏后的标准菌种进行划线接种，37℃恒温培养箱中培养24h后，再进行活化，使这些菌种有较强的活力[6]。

经复苏转种培养后，取新传代大肠杆菌、变异链球菌置于已灭菌的装有2mL培养基的有盖试管中，加入适量40%葡萄糖，置于37℃ 5%CO2培养箱内培养24h后，培养液用肉汤培养基稀释，充分振荡后经麦氏比浊管法调整菌液浓度为109CFU/mL。

1.2.3 微孔板法筛选抑菌活性 采用96孔微孔板进行抑菌活性的快速筛选[7]。分别取变异链球菌、大肠杆菌悬液用培养液50倍稀释，混匀。把维药材小檗果的不同极性提取物溶解在适宜溶剂中制成2000μg/mL的溶液，经微孔滤膜除菌后，在96孔板上用肉汤培养基与大肠杆菌、变异链球菌作连续对倍稀释，使含药浓度分别为1000、500、250、125、62.5μg/mL。相同条件下，并设溶剂对照、仅含菌液的空白对照，同一板重复4次，共置于37℃5%CO2培养箱内培养18h，以培养液透明度表示无菌生长的最低抑菌浓度（MIC值）。

1.2.4 抑菌效果的测定 用酶标仪于450nm波长处测定细菌的OD（Optical Density）值，将96孔板用蒸馏水清洗数遍，再用1%结晶紫染色15min，用蒸馏水冲洗至透明后，加入2%的SD洗脱生物膜，再用酶标仪于605nm波长处测试生物膜的OD值。抑菌率的计算方法如下：

1.2.5 数据处理及抑菌效果判断标准 中草药对细菌的最低抑菌浓度（MIC）测定国内外尚无统一标准，本文参照同类实验的标准作为判断标准[8]，以同一板同一样品4次重复的OD值计算抑菌率，求取平均值，并以MIC50为指标，即抑菌率大于50%，可以认为该样品抑菌效果明显。

2 结果与分析

2.1 小檗果不同极性提取物对变异链球菌的抑菌率

微孔板对倍稀释法测定小檗果5种提取物对变异链球菌菌株生长及其生物膜形成的抑制率，结果见表1、表2。

表2 小檗果不同溶剂提取物对变异链球菌生物膜形成的抑制率（%，Mean±SD，n=4）Table 2 The inhibition rate of different solvent extracts from Fructus berberis on the biofilm formationof Streptococcus mutans（%，Mean±SD，n=4）

由表1、表2可知，小檗果乙酸乙酯提取物对变异链球菌的生长有一定的抑制作用，但效果不明显；乙醇、水、乙酸乙酯提取物对变异链球菌生物膜的形成有较明显抑制作用，正丁醇提取物浓度为1000μg/mL时，抑制率为55.5%，但对倍稀释后，随着浓度降低，反而促进细菌生长。

2.2 小檗果不同极性提取物对大肠杆菌的抑菌率

微孔板对倍稀释法测定小檗果5种提取物对大肠杆菌菌株生长及其生物膜形成的抑制率，结果见表3、表4。

由表3、表4可知，小檗果乙酸乙酯提取物浓度在250～1000μg/mL范围内，对大肠杆菌的生长有一定抑制作用；乙酸乙酯、氯仿、正丁醇提取物对大肠杆菌生物膜的形成有不同程度的抑制作用，其中，氯仿提取物在1000μg/mL浓度时促进大肠杆菌生物膜形成，而浓度250μg/mL时的抑制率为57.8%。

表3 小檗果不同溶剂提取物对大肠杆菌生长的抑制率（%，Mean±SD，n=4）Table 3The inhibition rate of different solvent extracts from Fructus berberis on the growth of Escherichia coli（%，Mean±SD，n=4）

表4 小檗果不同溶剂提取物对大肠杆菌生物膜形成的抑制率（%，Mean±SD，n=4）Table 4 The inhibition rate of different solvent extracts from Fructus berberis on the biofilm formation of Escherichia coli（%，Mean±SD，n=4）

2.3 不同提取物对受试菌的MIC50

依据MIC50的判断标准，确定小檗果正丁醇提取物抑制变异链球菌生物膜形成的MIC50为1000μg/mL，乙酸乙酯和乙醇提取物为500μg/mL，水提取物为250μg/mL。小檗果乙酸乙酯提取物抑制大肠杆菌的MIC50为1000μg/mL；正丁醇、乙酸乙酯、氯仿提取物抑制大肠杆菌生物膜形成的MIC50分别为1000、500、250μg/mL。

3 结论与讨论

生物膜（Biofilm）是细菌的一种保护性生长模式，其被包裹在自身分泌的多聚物中形成具高度分化结构的特殊细胞群体结构，能不断释放浮游菌引起持续性感染，对抗生素和宿主免疫防御机制的抗性很强，80%的细菌性感染与其有关[9]，主要有由革兰阳性球菌导致的龋齿，革兰阴性厌氧性口腔细菌导致的牙菌斑，肠道细菌引起的胆囊感染，以及大肠杆菌和其他革兰阴性菌引起细菌性前列腺炎等[10]。由于抗生素滥用及细菌生物膜的强抗性导致很多细菌产生了耐药性，而中药抗菌机理特殊，不易产生耐药性，从天然产物中筛选抑菌活性成分成为研发热点[11]。

本文经化学鉴别预实验检出小檗果中含生物碱，糖和苷类，有机酸，甾体三萜，氨基酸、蛋白质和酚类鞣质等成分，小檗果提取物进行抑菌筛选时，发现有些含药组没有抑菌作用反而有促进细菌生长的的趋势，可能其所含糖类、蛋白质、氨基酸等成分为细菌生长提供了营养成分。根据实验结果，可判断小檗果中含有能有效抑制供试菌生长及其生物膜形成的活性成分，其不同极性提取物所含化学成分的类别和含量不同，使其抑菌活性不同，而同一提取物对不同菌种的抑制敏感性也存在差异。本方法为从小檗果的中寻找抑菌成分提供了实验依据，对其抑菌机理及对其他细菌生长的影响还有待进一步研究。

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Study on the antibacterial effect of extracts from Fructus berberis in vitro

TIAN Li1，2，YANG Jian3，TIAN Shu-ge2，*，WULIYA·Sayiti1，WU Ling-ling1
（1.College of Traditional Chinese Medicine，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China；2.Xinjiang Key Laboratory of Famous Prescription and Science of Formulas，Urumqi 830011，China；3.College of Pharmacy，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China）

TS255.1

A

1002-0306（2012）16-0148-03

2011-12-30 *通讯联系人

田莉（1974-），女，博士，副教授，研究方向：中药与民族药制剂研究。

新疆维吾尔自治区高校科研计划青年教师科研启动基金项目（XJEDU2009S62）。