两种酶标抗体制备方法的比较及李斯特菌TAS ELISA试剂盒性能的优化

刘雅莉，刘 芳，刘 箐，韩舜愈，孙志博，夏俊芳，朱小清

(1.兰州大学第二医院，甘肃兰州730030;2.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070;3.上海理工大学医疗器械与食品学院，上海200093;4.甘肃出入境检验检疫局国际旅行卫生保健中心，甘肃兰州730020;5.兰州大学基础医学院，甘肃兰州730000;6.甘肃出入境检验检疫局，甘肃兰州730020)

两种酶标抗体制备方法的比较及李斯特菌TAS ELISA试剂盒性能的优化

刘雅莉1，2，3，刘 芳4，刘 箐3，*，韩舜愈2，孙志博5，夏俊芳2，朱小清6

(1.兰州大学第二医院，甘肃兰州730030;2.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070;3.上海理工大学医疗器械与食品学院，上海200093;4.甘肃出入境检验检疫局国际旅行卫生保健中心，甘肃兰州730020;5.兰州大学基础医学院，甘肃兰州730000;6.甘肃出入境检验检疫局，甘肃兰州730020)

研制一种低成本、快速、准确的三抗体夹心酶联免疫(Three antibodies sandwich ELISA，TAS-ELISA)检测试剂盒。采用戊二醛法、改良过碘酸钠法分别制备碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，AP)、辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)标记的山羊抗兔IgG，比较单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)TAS-ELISA试剂盒两种酶标抗体的检测效果，并考察了试剂盒的检测灵敏度、特异性、稳定性、保存周期等指标。结果表明，采用改良过碘酸钠法制备的HRP-IgG效果好，克分子比最高可达2.9，酶结合率达27%;试剂盒检测周期6h，检测成本为3.5元/孔，特异性实验、干扰实验、重复性实验、稳定性实验表明采用该方法制备的酶标抗体，特异性好、结果稳定可靠。自制TAS-ELISA试剂盒检测性能可达到商业化试剂盒水平，为该产品的产业化提供了一定的理论依据。

单核细胞增生性李斯特菌，改良过碘酸钠法，碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，三抗体夹心ELISA

Abstract:To develop a low-cost，rapid and accurate TAS-ELISA KIT.This study preparated AP-IgG and HRP-IgG by glutaraldehyde method and improved periodate method respectively and compared two enzyme conjugates of Listeria monocytogenes TAS-ELISA KIT，further investigated some indexes including the sensitivity，specificity，stability，shelf life.The results showed that HRP-IgG preparated with improved periodate method was more effective，the molar ratios was 2.9，the rate of enzyme-labeled was 27%.The detection time of KIT was 6h，the detection cost was ¥3.5/well.Specific experiment，interference experiment，repetitive experiment and stable experiment indicated that the HRP-IgG preparated with improved periodate method was specific and reliable.The performance of self-made TAS-ELISA KIT could reach commercial KIT，it also could provide theoretical basis for industrialization of the product.

Key words:Listeria monocytogenes;improved periodate method;AP;HRP;TAS-ELISA

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)是WHO公认的四大食源性致病菌之一，已被许多国家列为食品安全零检出项目。目前针对LM的检测方法主要有传统微生物培养、胶体金试纸条、ELISA、PCR、免疫捕捉 PCR、实时荧光定量PCR、多重PCR、免疫磁珠PCR、PCR-变性高效液相色谱、PCR-核酸层析、基因芯片、电子鼻、环介导等温扩增［1-10］等，这些检测手段或操作繁琐、或特异性不强、或成本过高，严重影响了检测质量，降低了检测效率，延长了检测时间，增加了检测成本;ELISA方法是实验室最为常用的检测手段，但是目前针对食源性致病菌的ELISA全套试剂盒需从国外公司购买，检测成本高，严重制约了ELISA试剂盒在我国食品安全检测中的普及;因此，本研究旨在建立一种成本低廉、稳定性好、适于国内试剂盒产业化的酶标抗体的方法。ELISA分为间接 ELISA(Indirect ELISA)、竞争ELISA(Competitive ELISA)、双抗体夹心ELISA(DoubleantibodiessandwichELISA，DASELISA)、三抗体夹心ELISA(Three antibodies sandwich ELISA，TAS-ELISA)，其中以 DAS-ELISA和 TASELISA最为常用。与DAS-ELISA相比，TAS-ELISA具有以下优点:a.TSA-ELISA进行酶标记的抗体是通用的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG，它可以结合所有兔源或鼠源的抗体，这样只需一株酶标羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG，即可满足所有相关试剂盒检测抗体需求，大大降低了实验成本;DAS-ELISA需要对第二株抗体进行酶标记，由于不同抗体的特殊性，无法保证酶标抗体的质量和稳定性，若购买进口酶标检测抗体，则大大增加了检测成本;b.TSA-ELISA在DASELISA双抗体夹心的基础上，采用第三株酶标抗体进行酶促反应，特异性比DAS-ELISA好，可以减少假阳性、假阴性的出现。本研究采用戊二醛法、改良过碘酸钠法分别制备碱性磷酸(Alkaline Phosphatase，AP)、辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)标记的山羊抗兔IgG，并比较了两种方法的优缺点，建立了一种适用于食品中LM的TAS-ELISA检测试剂盒的抗体酶标技术，为该试剂盒在我国的产业化提供了依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

碱性磷酸酶(500U) 宝生物工程(大连)有限公司;辣根过氧化物酶(RZ＞3.0) 兰州鹏程生物;BCA蛋白浓度测定试剂盒 碧云天公司;过碘酸钠Sigma公司;LM单克隆抗体(ab11439)、多克隆抗体(ab20506) Abcam公司;山羊抗兔 IgG抗体(SA27) Solarbio公司;HRP-羊抗兔抗体 中杉金桥。

全自动酶标仪MK3 芬兰雷勃公司;高速离心机3K30 Sigma公司;磁力搅拌器RCT基本型 IKA公司。

1.2 实验方法

1.2.1 梯度菌液、模拟带菌菌液、底物溶液的制备LM标准菌株用脑心浸液肉汤培养后稀释101～108倍，并进行平板计数(各梯度纯菌悬液分别设3个重复)，梯度菌液计数结果为 1.37×109～1.37×101cfu/mL。

选取易受LM污染的6种食品(牛奶、果汁、酸奶、雪糕、香肠、生猪肉)各25g碾碎并与250mL无菌磷酸盐缓冲液混合，以此为稀释液梯度稀释LM纯菌液，制备梯度模拟菌液。

HRP显色底物溶液(四甲基联苯胺，TMB)的配制。A液:3mg/mL TMB(30mgTMB粉末、10mL二甲基亚砜);B液:柠檬酸溶液(柠檬酸 4.41g、Na2HPO4·12H2O 20.77g、无菌水 500mL、pH5.5)。使用前将A液1mL、B液19mL混合并加入14μL双氧水混匀备用。

1.2.2 山羊抗兔IgG抗体浓度的测定 用生理盐水将山羊抗兔IgG抗体稀释不同倍数(100、500、1000倍)，同时用生理盐水作阴性对照，采用BCA试剂盒测定抗体浓度，操作方法参照试剂盒说明书(编号P0012)。

1.2.3 戊二醛法制备AP-羊抗兔IgG 280μL PBS中加入 20μL AP、2.4μL戊二醛混匀后室温静置3～5h;取混合液装入透析袋 PBS中 4℃冰箱透析18h;次日将透析袋中液体小心吸出，并加入山羊抗兔IgG，混匀后室温静止5h;再次PBS 4℃冰箱透析18h，吸出酶标抗体备用。

1.2.4 改良过碘酸钠法［11］制备HRP-羊抗兔IgG取5mg HRP溶于2mL无菌水中，并加入NaIO4若干，0℃放置若干分钟;混合液于醋酸钠缓冲液中4℃透析12～24h;小心吸出混合液，加入乙二醇若干，0℃封闭1h;混合液加入山羊抗兔IgG若干，于CB缓冲液中4℃透析12～24h;结合物加入 NaBH4若干量，4℃还原3h;加入等体积饱和硫酸铵，4℃盐析24h;次日取出混合物6000r/min离心20min，弃上清，沉淀用0.5mL生理盐水溶解备用;若需长期保存可加入等体积甘油，-20℃保存备用。整个操作步骤注意避光。

1.2.5 改良过碘酸钠法的优化 乙二醇还原步骤的优化:NaIO4氧化后加入乙二醇，再用醋酸钠缓冲液透析;NaIO4氧化并醋酸钠缓冲液透析后，乙二醇还原。

NaIO4氧化浓度的优化:5mg HRP中分别加入21mg/mL 的 NaIO40.2、0.3、0.4、0.5mL。

NaIO4氧化时间的优化:0℃冰浴摇动15、30、45、60min。

乙二醇还原量的优化:5mg HRP分别需要0.16mol/L 乙二醇 0.3、0.5、0.7、0.9mL。

酶、抗体最佳结合比例的优化:酶∶抗体质量比分别为 2∶1、1∶1、1∶2、1∶3。

NaBH4封闭量的优化:5mg HRP中分别加入5mg/mL NaBH40.1、0.3、0.4、0.5mL。

1.2.6 酶标抗体(HRP-山羊抗兔IgG)质量的鉴定按照以下公式计算酶量、IgG量、克分子比、酶结合率(仅针对改良过碘酸钠法制备的酶标抗体)。

酶量(mg/mL)=OD403×0.4;IgG量(mg/mL)=克分子比=酶量×4/IgG量;酶结合率(%)=酶量/5mg×100(OD403是酶中铁叶琳辅基的吸光度，OD280是抗体-酶蛋白中的色氨酸、酪氨酸的吸光度)。

1.2.7 试剂盒封闭液的优化 TAS-ELISA检测中的封闭步骤至关重要，如果封闭不好很可能导致本底过高。本研究采用6种不同的封闭液进行封闭实验(5%BSA、10%BSA、5%BSA+5% 蔗糖、10%BSA+5%蔗糖、3%明胶、5%明胶)，以期达到最优的封闭效果。

表1 两种自制酶标抗体不同稀释度检测结果比较Table 1 The comparison on two kinds of self-enzyme conjugates from different dilutions

1.2.8 试剂盒灵敏度测定 LM单克隆抗体包被酶联板(1μg/mL)4℃过夜;PBST洗涤后封闭液37℃封闭1h;PBST洗涤;加入样品，37℃ 2h;洗涤后加入LM多克隆抗体(1μg/mL)37℃ 1.5h;洗涤并加入自制酶标抗体，37℃1.5h;PBST洗涤，TMB显色 5～10min(AP底物为PNP)，2mol/L浓硫酸终止反应，测OD450(AP测OD405)，判断原则:阴性对照OD＜0.1且阳性对照OD/阴性对照OD＞2.0表明实验成功、实验结果可靠;样品OD/阴性OD﹥2.0为阳性、样品OD/阴性OD﹤2.0为阴性。

1.2.9 试剂盒特异性实验、干扰实验 特异性实验:TAS-ELISA试剂盒检测LM等20株致病菌，来验证试剂盒检测LM的特异性，观察是否有交叉反应、是否有假阳性出现。

干扰实验:将LM与其他致病菌1∶1等量混合后取100μL为样品加入酶联孔中，观察其它致病菌是否对TAS-ELISA检测LM有非特异性干扰、是否有假阴性出现。

1.2.10 试剂盒重复性和稳定性测定 试剂盒板内重复性实验:在同一包被板上，以109cfu/mL的纯菌液、牛奶、果汁、酸奶、雪糕、香肠、生猪肉为样品(每个样品5个反应孔，同时设置阴性对照)，利用自制的TAS-ELISA试剂盒进行检测，计算每个样品OD450的平均值与标准偏差，进而计算每个样品的板内变异系数(以上实验重复5次)。

试剂盒板间重复性实验:取5个包被板，以109cfu/mL的纯菌液、牛奶、果汁、酸奶、雪糕、香肠、生猪肉为样品(每个样品在每个包被板上设置1个反应孔，同时设置阴性对照)，进行TAS-ELISA检测，计算每个样品OD450的平均值与标准偏差，进而计算每个样品的板间变异系数(以上实验重复5次)。

1.2.11 试剂盒保存期实验 将制备好的酶标抗体、底物溶液、试剂盒(包括已包被抗体的酶联板、各种缓冲液、抗体、底物溶液)置于4℃冰箱保存，并于0、30、60、90d对其进行 TAS-ELISA检测。

2 结果与讨论

2.1 山羊抗兔IgG浓度的测定

BCA浓度测定试剂盒检测结果:山羊抗兔IgG平均浓度为104.58mg/mL(图1)。

2.2 两种自制酶标抗体检测结果

图1 山羊抗兔IgG抗体浓度测定结果Fig.1 The concentration of goat anti-rabbit IgG

表1结果显示:AP-山羊抗兔IgG仅在稀释10倍时有微弱的颜色反应，且成本较高(500U AP仅能制备酶标抗体20μL);而自制HRP-山羊抗兔IgG在稀释1500倍时仍有较强的颜色反应，说明HRP-山羊抗兔IgG效果优于AP-山羊抗兔IgG。分析其原因主要如下:戊二醛法仅有2%～10%的酶与40%的抗体蛋白结合，而且结合物有效部分只占5%，酶和抗体的利用率低;过碘酸钠改良法在低pH条件下直接氧化HRP，可以使70%～90%的酶与99%的抗体蛋白结合，交联效果好、酶失活小，且酶活性不受影响。有文献表明HRP可提高检测灵敏度［12-13］，且改良法HRP自身交联率仅为5%，标记效果优于戊二醛法、经典过碘酸钠氧化法、戊二醛-过碘酸钠氧化法［11，14］。

2.3 改良过碘酸钠法优化实验酶标抗体质量的鉴定

改良过碘酸钠法优化实验结果表明(表2)，氧化5mg HRP用0.2mL 21mg/mL NaIO4效果最好，此时酶溶液会立即呈现灰绿色，这是由于酶分子中含有铁叶啉，故氧化过程中颜色的改变也是证明HRP有无彻底氧化的最佳证据。NaIO4氧化时间在15min已能满足要求，时间过短则不能彻底氧化，过长则会降低酶活力，导致结合物效价降低。有些文献在HRP的标记过程中没有乙二醇还原的步骤，本实验证明加入乙二醇是极其必要的，因为NaIO4可以在很短的时间内将乙二醇氧化成乙二醛，这样可以阻止NaIO4对酶的继续氧化，有效避免了氧化过度造成的酶活力下降。加入乙二醇后原来的灰绿色溶液逐渐恢复了原来的橙色，实验证明0.3mL 0.16mol/L乙二醇已经足以阻止氧化剂对酶的过度氧化。酶与抗体结合的质量比是整个实验的关键步骤，实验表明“酶∶抗体质量比=1∶2”时能够达到最大的结合效率，2∶1、1∶1、1∶3 时效果都不好，这与其他研究者的结果一致［15］;用饱和硫酸铵沉淀时，酶结合物(橙色)在沉淀部分，“酶∶抗体质量比=2∶1”实验组上清出现橙色，说明酶过量，即上清中存在未结合的酶;1∶1、1∶2、1∶3实验组上清接近无色，表明酶与抗体几乎完全结合;少量未结合的酶可以通过离心或洗涤的方法除去，不会影响最终的显色;但是如果抗体量过多，那么未标记的抗体会与酶标抗体竞争结合抗原，减少了结合到固相上的酶标抗体的量，所以绝不能使抗体的量远大于酶的量。5mg HRP中加入5mg/mL NaBH40.1mL，此时未见明显气泡产生;而加入0.3、0.4、0.5mL时，管壁产生大量气泡。资料显示，酶标抗体克分子比为0.7则标记效果一般，为1.0效果较好，大于1.5效果满意;酶结合率7%效果一般，9%～10%效果较好，高于25%为满意。本实验室根据上述优化结果制备的酶标抗体克分子比最高可达2.9，酶结合率达27%，标记效果较为满意。

表2 酶标记抗体(HRP-山羊抗兔IgG)质量的鉴定Table 2 The identification of HRP-IgG

表3 自制酶标抗体、商业化酶标抗体TAS-ELISA试剂盒检测灵敏度Table 3 The sensitivity of self-made enzyme conjugates and commercial enzyme conjugates

2.4 试剂盒最优封闭液的确定

图2中10%BSA、10%BSA+10%蔗糖、3%明胶、5%明胶封闭效果不好，可能是封闭不当造成的阴性本底过高;与“5%BSA”相比，“5%BSA+10%蔗糖”效果更好，这可能是由于蔗糖起到了固化剂的作用，使BSA封闭效果更佳。

2.5 试剂盒灵敏度实验结果

表3结果显示:自制酶标抗体、商业化酶标抗体TAS-ELISA试剂盒在纯菌液、果汁、酸奶、雪糕、香肠、生猪肉中的检测灵敏度一致，依次是106、107、107、106、108、109cfu/mL;在牛奶中两种方法的检测灵敏度分别为 107、109cfu/mL。

2.6 试剂盒特异性实验、干扰实验结果

自制TAS-ELISA试剂盒特异性实验结果显示(表4):LM的检测结果呈阳性，其他18株致病OD450均低于0.1，无假阳性出现，表明该方法检测LM特异性好。干扰实验结果显示:金黄色葡萄球菌等18株常见致病菌对该法没有干扰，即使有一半其他杂菌的存在，该方法也可特异性检出LM，不会有假阴性的出现。

表4 自制TAS-ELISA试剂盒特异性实验、干扰实验结果Table 4 The result of specific experiment and interference experiment by Self-TAS-ELISA KIT

表5 试剂盒板内重复性实验结果Table 5 The repeatable result in the same 96-well plate

图2 6种不同封闭液的检测结果Fig.2 The test result of six different blocking solution

2.7 试剂盒的重复性、稳定性

表5、表6重复性实验表明:自制酶标抗体TASELISA试剂盒板内变异系数在0.89%～2.99%之间，板间变异系数在0.93%～4.74%之间。一般ELISA要求板内变异系数低于5%、板间变异系数低于10%［16］，本试剂盒均符合以上要求，说明该试剂盒重复性好、准确度高。

HRP常用的底物有邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、2，2＇-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐(ABTS)等。本研究采用TMB作底物的主要原因是:TMB经酶作用后由无色变蓝色，目测对比鲜明，加酸停止酶反应后变黄色，可在比色计中定量，无致癌作用;且张喜悦等［17］的研究证明，TMB较OPD、TMB、ABTS而言，更适合做 ELISA实验的底物。

2.8 试剂盒的保存期

图3显示:自制酶标抗体、TMB底物溶液、试剂盒0～90d检测结果OD值基本保持一致、无显著差异，表明其在4℃冰箱至少可以保存90d，说明该试剂盒具有较好的稳定性。

2.9 试剂盒的检测成本、检测周期

试剂盒成本:Abcam公司LM单克隆抗体(4000元、2500孔)成本1.6元/孔;Abcam公司LM单克隆抗体(4000元、4000孔)成本1.0元/孔;Solarbio公司山羊抗兔IgG抗体价格较低，小于0.5元/孔;因此自制TAS-ELISA试剂盒成本小于3.5元/孔。

检测周期:检测时直接在已经包被LM单克隆抗体的酶联板中加入样品，孵育2h;封闭1h;洗涤后加入LM多克隆抗体，孵育1.5h;加入自制酶标抗体，37℃1.5h;TMB显色5～10min后浓硫酸终止反应，整个检测周期少于6h。

表6 试剂盒板间重复性实验结果Table 6 The repeatable result in the different 96-well plate

图3 试剂盒保存期实验Fig.3 The result of validity by Self-TAS-ELISA KIT

3 结论

TAS-ELISA是一种以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合的一种敏感性很高的实验技术。本研究制备的酶标抗体克分子为2.9，酶结合率达27%，标记效果满意;自制酶标抗体TAS-ELISA试剂盒检测限与商业化酶标抗体TAS-ELISA试剂盒相同，特异性实验、干扰实验表明常见食源性致病菌对该法没有抑制和干扰，同时试剂盒具有较好的稳定性(板内变异系数最高为2.99%、板间变异系数最高为4.74%)，检测成本为3.5元/孔，使用包被好抗体的酶联板，检测周期仅需6h。TAS-ELISA试剂盒不需提取DNA、不需增菌、可同时检测大量样品，大大节省了检测时间，是一种灵敏、特异、快速、高通量、低成本的检测技术。另外，TAS-ELISA较DAS-ELISA成本低、特异性好，提高了实验的可靠性与准确度，完全适合日常检测，有较高的使用价值和应用前景。

［1］刘雅莉，刘箐，韩舜愈.微量病原检测技术研究进展［J］.生物技术通报，2010，11:76-80.

［2］Urban Traunšek，Nataša Toplak，Barbara Jeršek，et al.Novel cost-ef fi cient real-time PCR assays for detection and quantitation of Listeria monocytogenes［J］ .Journal of Microbiological Methods，2011，85(1):40-46.

［3］Mahmuda Yasmin，Susumu Kawasaki，Shinichi Kawamoto.Evaluation of multiplex PCR system for simultaneous detection of Escherichia coli O157∶H7，Listeria monocytogenes and Salmonella enteritidis in shrimp samples［J］.Bangladesh Journalof Microbiology，2007，24(1):42-46.

［4］G Amagliani，E Omiccioli，A del Campo，et al.Development of a magnetic capture hybridization-PCR assay forListeria monocytogenes direct detection in milk samples［J］.Journal of Applied Microbiology，2006，100(2):375-383.

［5］王耀，曹际娟，闫平平，等.食品中3种致病李氏菌MPCRDHPLC检测方法的建立［J］.食品科学，2010，31(8):158-162.

［6］王丽丽，赵瑜，林松.食品中单增李斯特菌PCR-NALF检测方法的研究［C］.第四届中国北京国际食品安全高峰论坛论文集，2011.

［7］Ho Seop Eom，Byeong Hee Hwang，Duk-Hee Kim，et al.Multiple detection of food-borne pathogenic bacteria using a novel 16S rDNA-based oligonucleotide signature chip［J］.Biosensors and Bioelectronics，2007，22(6):845-853.

［8］喻勇新，孙晓红，潘迎捷，等.应用电子鼻检测食源性致病菌的研究［J］.化学通报，2010(2):154-159.

［9］MJ Tang，S Zhou，XY Zhang，et al.Rapid and sensitive detection of Listeria monocytogenes by loop-mediated isothermal amplification［J］.Current Microbiology，2011，63(6):511-516.

［10］何勇琴，潘迎捷，卢瑛.食品中单核细胞增生性李斯特菌的快速分离鉴定［J］.食品工业科技，2011，32(3):215-218.

［11］王晓俭.两种不同制备酶标记结合物方法的比较［J］.青岛大学医学院学报，2003，39(1):49-52.

［12］庄翘楚.快速检测双歧杆菌的ELISA试剂盒的研制［D］.哈尔滨:东北农业大学，2008.

［13］戚红卷，苏红，升启.辣根过氧化物酶(HRP)底物的研究进展［J］.军事医学科学院院刊，2007，31(6):560-563.

［14］牛发良，侯亚利，李俊杰，等.三种辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG方法的比较［J］.张家口医学院学报，2002，19(1):24-26.

［15］刘玉翠，邹岳奇，阎静辉.辣根过氧化物酶标记单克隆抗体的初步研究［J］.河北省科学院学，1991(1):39-42.

［16］吕瑶.抗HBsAg鸡卵黄抗体的制备及HBsAg夹心ELISA检测方法的初步建立［D］.雅安:四川农业大学，2010.

［17］张喜悦，徐天刚，王志亮，等.酶联免疫吸附实验三种底物的比较实验［J］.中国动物检疫，2003，20(11):23-24.

Comparison of two methods in preparation of enzyme conjugates and optimization of Listeria monocytogenes TAS-ELISA KIT

LIU Ya-li1，2，3，LIU Fang4，LIU Qing3，*，HAN Shun-yu2，SUN Zhi-bo5，XIA Jun-fang2，ZHU Xiao-qing6
(1.The Second Affiliated Hospital of Lanzhou University，Lanzhou 730030，China;2.College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China;3.School of Medical Instrument and Food Engineering，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai 200093，China;4.Internation Travel Healthcare Center of Gansu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Lanzhou 730020，China;5.School of Basic Medical Sciences，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China;6.Gansu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Lanzhou 730020，China)

TS207.3

A

1002-0306(2012)15-0301-07

2011-12-26 *通讯联系人

刘雅莉(1984-)，女，硕士，研究方向:食源性致病菌的快速检测。

质检总局科研项目(GSCIQ_2010IK220)。