青海沙棘不同部位总黄酮含量比较研究

谢久祥，林恭华，都玉蓉，巨海兰，索有瑞，张同作*

1中国科学院西北高原生物研究所，西宁 810008;2中国科学院大学研究生院，北京 100049;3青海师范大学，青海 810008;4青海省大通县森防站，大通 810100

沙棘(Hippohae rhamnoides L.)隶属胡颓子科(Elaeagnaceae)沙棘属，又名黑刺、醋柳、沙枣，为落叶灌木或乔木，产于欧亚两洲［1］。沙棘具有很高的药用和食用价值，是蒙古族、藏族惯用药材［2］。近年来研究发现，沙棘中主要活性成分为黄酮类化合物［3-5］。黄酮类化合物是一类具有重要生物活性的物质，能显著增加冠状动脉血流量，增加心肌营养血流量，降低心肌耗氧量，抑制血小板聚集，对心率失常、高血脂、心肌缺血具有明显改善效果，可预防心脑血管疾病［6-8］。

沙棘果、叶及全株都含有黄酮类等活性物质和其他营养物质［9］。沙棘叶已被开发为配制维生素和类黄酮制剂的重要原料［10］，也被开发为保健茶［11］、保健酒［12］和沙棘饲料［13］，俄罗斯甚至把沙棘叶作为生产面包的重要原料［14］。沙棘根和茎韧皮部厚实，对人类也具有潜在的药用价值，但目前还没有相关报道。沙棘不同部位总黄酮含量方面已有一些报道［15-18］，但涉及茎、叶的较少，其根部总黄酮含量测定还未见报道。

沙棘在我国南北均有分布，总面积超过2.13×104km2［19］。青海省目前拥有天然沙棘林面积 5.3万hm2，人工沙棘林面积7.3万hm2，未成林造林面积7.4万hm2，其后备资源丰富，发展沙棘产业潜力很大［20］。本实验对青海天然沙棘根、茎和叶3个部位总黄酮含量进行测定，为沙棘资源的合理开发和利用提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 主要仪器、试剂

2009年10月，于青海大通县干沟乡(海拔2927，E 101°34'10.91″，N 36°57'09.02″)采集沙棘样品10株。

721型数显可见分光光度计(上海菁华)，DU 640核酸蛋白分析仪(Beckman Coulter)HH-4恒温水浴锅(国华电器)，101A-2电热鼓风恒温干燥箱(天津泰斯特)，DZF-1型(6050B)真空干燥箱(上海福玛)，ACCULAB万分之一电子天平(Satorius Group)。

芦丁标准品(科翔生物，纯度≥98%)，无水乙醇、95%乙醇、硝酸铝 Al(NO3)3.9H2O(100 g/L)、醋酸钾(9.8 g/L)均为分析纯(安徽安特生物化学有限公司)，实验水为蒸馏水。

1.2 试验原理

溶于乙醇的黄酮类化合物在弱碱性条件下，与显色剂三价铝离子结合生成有色物质，可在415 nm波长附近产生最大吸收。在一定的浓度范围内，其吸光度值与黄酮类化合物含量成正比。与标准曲线比较，可定量测定黄酮类化合物的含量［21］。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理和提取液制备

将沙棘根、茎和叶样品经105℃杀青、75℃干燥至恒重后，粉碎，过40目筛，准确称取粉末1.000 g，置100 mL 烧杯中，加入乙醇(95%)30 mL，烧杯置于65℃ 水浴锅中加热45 min，搅拌使之溶解。取出后冷却至室温，上清液使用快速滤纸过滤。烧杯、漏斗、滤渣及滤纸用少量乙醇(95%)洗涤至滤液无色。最后用乙醇(95%)稀释至50 mL，摇匀，待测。

1.3.2 标准溶液的配制

精确称取经120℃减压真空干燥至恒重的芦丁对照品50 mg，置于50 mL容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得到芦丁对照品储备液。精密吸取芦丁对照品储备液10 mL，置于50 mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得到芦丁对照品使用溶液，其浓度为0.2 mg/mL。

1.3.3 测定波长选择

分别移取一定的芦丁对照品溶液，用DU 640核酸蛋白分析仪(Beckman Coulter)在300～500 nm范围扫描，发现芦丁和样品在415 nm处均有最大吸收波长，因此将415 nm作为测定波长。

1.3.4 校准曲线制作

1.3.4.1 取芦丁对照品使用溶液 0，0.50，1.00，2.50，3.75，7.5，10，12.5 mL，分别放人 25 mL 容量瓶中。

1.3.4.2 加 95% 乙醇至总体积为 7.5 mL，依次加入硝酸铝溶液0.5 mL，醋酸钾溶液0.5 mL，摇匀，加水至刻度，摇匀。静置1h，所得标准液浓度依次为0.004，0.008，0.02，0.03，0.06，0.08，0.10 mg/mL。

1.3.4.3 用1 cm比色皿于415 nm处，以30%乙醇为空白，测定吸光度。

1.3.4.4 以25 mL 容量瓶中芦丁浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，用Excell软件计算其回归方程。精密吸取待测试料溶液0.5 mL，置于25 mL容量瓶中，按校准曲线制作方法进行操作。以空白试液(取芦丁对照品使用溶液0 mL)作参比，用1 cm比色皿，用分光光度计在波长415 nm处测定试料溶液的吸光度。通过回归方程计算，求出试料溶液中的黄酮类化合物含量(mg)。

1.3.5 精密度试验

分别精密吸取芦丁对照品使用溶液1 mL，重复测定6次，计算RSD。

1.3.6 稳定性试验

精密吸取2.2.1制备的提取溶液和上述两标准液各l mL，每10 min测定1次吸光度，考察(60 min)，计算 RSD。

1.3.7 回收率测定

精密吸取制备的提取液5份，分别置10 mI容量瓶中，加入一定量芦丁对照品，按测定波长项下处理，计算平均回收率和RSD。

2 结果

2.1 波长确定和校准曲线绘制

2.1.1 波长确定

图1 芦丁吸光度标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin absorbance

经测定，在波长415 nm处芦丁对照品有最大吸收、样品也有较大吸收，确定测定波长为415 nm。

2.1.2 校准曲线绘制

经计算得到芦丁标准曲线的回归方程为y=8.3684x+0.0049，相关系数 R2=0.9996，在 0.008-0.06 mg/mL范围内呈良好的线性关系(图1)。

2.2 精密度、稳定性、重现性、回收率试验结果

以芦丁为标准品，精密度和稳定性试验的RSD分别为 0.040%(表1)和0.138%(表2)，平均回收率为99.05%，RSD 为1.28%(表3)。样品的稳定性实验RSD为1.201%(表2)。以上结果表明两种测定方法的精密度、稳定性良好，经回收率试验证明都具有良好的准确度和重现性，适用于芦丁总黄酮的测定。

表1 精密度试验Table 1 The results of precision test

表2 稳定性试验Table 2 The results of stability test

表3 加样回收率实验Table 3 The results of plus sample recovery test

2.3 沙棘不同部位总黄酮含量

表4表明，沙棘根、茎和叶中总黄酮含量分别为:5.12 ±1.07 mg/g，(n=10)、11.37 ±1.89 mg/g(n=10)、95.87 ±8.62 mg/g(n=10)，各部位总黄酮含量差异显著(n=30，P＜ 0.01)，叶中最高，根中最低。

表4 沙棘不同部位黄酮含量测定结果Table 4 Content distribution of total flavonoids in different parts of sea buckthorn

3 讨论

总黄酮含量的测定方式一般有分光光度法和高效液相色谱法，高效液相色谱法虽然重现性、稳定性等指标均较好，但仪器设备昂贵，操作复杂，费用较高。分光光度法测定黄酮含量，不但操作简单方便，而且结果准确可靠［22］。本实验以乙醇为提取剂，利用水浴法提取沙棘叶黄酮类化合物，以芦丁作标准品，在415 nm处测定吸光度，所得校准曲线线性良好，稳定性良好，精密度良好，为沙棘总黄酮含量测定的一种简便可行的方法。

本实验表明，沙棘是西北地区木本植物中总黄酮含量较高的植物，其含量仅次于龙柏叶(197.5 mg/g)和茶树(Camellia sinensis)叶(99.39 mg/g)［23］。青海沙棘叶片中总黄酮含量远远高于山西沙棘(24.19 mg/g)［24］、陕西沙棘(5.40 mg/g)［16］、河北沙棘(12.98 mg/g)［25］。我们的试验结果和邸多隆等人关于沙棘叶总黄酮含量(65.4 mg/g)［26］的报道是一致的，都证明青海沙棘叶片中总黄酮含量在全国沙棘中处于最高水平。这是采样地的高海拔、强辐射和高寒气候造成的［27］。沙棘叶中总黄酮含量为根的18.7倍、茎中总黄酮含量约为的倍8.4，沙棘叶总黄酮开发利用价值最高。

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