应用荧光偏振检测方法对出口牛进行布氏杆菌病检测

王玉玲，柴铭骏，刘红梅

（天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，天津塘沽 300461）

布氏杆菌病（Brucellosis）（又称布鲁氏菌病）是由布氏杆菌（Brucella）引起的人兽共患传染病，其特征是生殖器官和胎膜发炎，引起流产、不育和各种组织的局部病灶。布氏杆菌病在牛、羊、猪等家畜中最常发生。本病很容易传播给人，引起一种波浪热的急性发热性疾病，也可以发展成慢性，引起肌肉、骨骼、心血管系统和中枢神经系统的严重并发症。

布氏杆菌病可通过口腔、呼吸道、结膜炎或其他可能的途径，通常是职业性接触而被感染，摄入感染的奶制品是对公共卫生的主要危险。同时本病亦可由牛、羊、猪传染于其它家畜。由于布氏杆菌病对公共卫生的意义极大，对畜群的危害大，且广泛分布于世界各地，可引起不同程度的流行，给畜牧业和人类的健康带来严重危害，世界动物卫生组织（OIE）将其列为一种对国际贸易有重要影响的疫病[1]，我国农业部将其列为二类动物疫病，并将其列为进境动物二类传染病[2]。

布氏杆菌病主要依靠实验室检测结果并结合流行病学进行确诊。目前常用的检测方法有平板凝集、试管凝集、补体结合和酶联免疫吸附试验。荧光偏振检测方法（FPA）是一种新的试验方法，本文应用FPA对我国出口哈萨克斯坦的牛进行布氏杆菌病检测，同时用补体结合试验（CFT）、平板凝集试验（RBPT）、试管凝集试验（SAT）、间接ELISA（iELISA）、竞争ELISA（cELISA）进行检测方法的比对，现将检测情况报告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 布氏杆菌病虎红平板凝集抗原、试管凝集抗原、补体结合抗原、补体、溶血素、标准阳性血清、标准阴性血清均购自中国兽药监察所，布氏杆菌病间接ELISA、竞争ELISA试剂盒购自北京测迪公司，布氏杆菌病荧光偏振试剂盒购自美国。

1.1.2 血清样品 采自出口哈萨克斯坦牛的321份血清样品。

1.2 方法

1.2.1 虎红平板凝集试验、试管凝集试验、补体结合试验按出入境检验检疫行业标准SN/T1088-2010进行。

1.2.2 间接ELISA试验、竞争ELISA试验方法按试剂盒使用说明书进行。

1.2.3 荧光偏振检测方法 取20 μL血清样品加入黑色96孔微量反应板内，加180 μL反应缓冲液，室温孵育3 min，置荧光偏振仪上读板，加结合物10 μL，室温孵育2 min，置荧光偏振仪上读板，两次读取值的差值与阴性对照的差值进行比较，判定阴阳性结果。

2 结果

2.1 荧光偏振试验 321份血清样品中有25份样品为FPA试验阳性反应（见表1）。

2.2 虎红平板凝集试验 321份血清样品中有17份样品为平板凝集试验阳性反应（见表1）。

2.3 试管凝集试验 321份血清样品中有18份样品为试管凝集试验阳性反应（见表1）。

2.4 补体结合试验 321份血清样品中有10份样品为补体结合试验阳性反应（见表1）。

2.5 间接ELISA试验 321份血清样品中有21份样品为iELISA试验阳性反应（见表1）。

2.6 竞争ELISA试验 321份血清样品中有26份样品为cELISA试验阳性反应（见表1）。

表1 六种血清学方法检测牛布氏杆菌病的阳性结果比对

3 讨论

3.1 FPA的原理是溶液中的分子作随机转动，分子的大小是影响转动速率的主要因素，与其成反比关系，因而小分子较大分子转动得快。如果给分子标记上荧光色素，通过一定角度的转动时间即可通过测量水平和垂直的偏振光强度来确定。因而大分子比转动快的小分子发射更多的偏振光。

一般以分子量小于50KD的抗原用荧光素标记，荧光标记的小分子抗原在溶液中旋转速度快，荧光偏振光强度小。当加入被检血清或全血时，荧光标记的小分子抗原与其相应抗体结合后，所形成的大分子在溶液中旋转速度变慢，荧光偏振光强度增大。通过荧光偏振仪测量，将获得的偏振光差值与阴性对照偏振值比较，即可判定出样品的阴阳性。

3.2 以两种试验方法检测为阳性的样品即认定该样品为阳性的规则看，SAT有1份样品为假阳性，FPA未出现假阳性，说明FPA的特异性较高；用RBPT、SAT（假阳性除外）、CFT、iELISA方法检测为阳性的样品，用FPA方法均能检测为阳性，而用RBPT、SAT、CFT、iELISA不能检测出阳性的样品，用FPA仍能检测出阳性，说明FPA的敏感性也较高。FPA的检测结果与cELISA结果最接近，说明FPA敏感性和特异性接近于cELISA。

3.3 FPA方法简便快速，可在15分钟内完成92份样品的布氏杆菌病检测，不需要象ELISA那样的洗板步骤。

目前在国际贸易中，在双边签订的检疫议定书中，对于牛、猪、羊的布氏杆菌病检测主要采用的方法为RBPT、SAT、CFT[2]；FPA从敏感性和特异性上都优于或等于目前主要采用的RBPT、SAT、CFT、ELISA检测方法。不论从检测方法的简便快速上，还是从敏感性和特异性上看，FPA试验都是一个较为理想的、可靠的检测布氏杆菌病抗体的血清学方法，FPA可用于布氏杆菌病抗体检测和畜群布氏杆菌病筛查和净化。

[1]世界动物卫生组织（OIE）.陆生动物诊断试验和疫苗手册[M].//农业部兽医局，中国动物卫生与流行病学中心，译.5版.北京：农业部兽医局，2004：363-364.

[2]于大海，崔砚林.中国进出境动物检疫规范[M].北京：中国农业出版社，1997.