甜菜夜蛾P450基因的克隆及组织特异性分析

郑笑笑，魏 苹，赵丽娜，王世贵，党向利，张秋伶，唐 斌

（1.杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江杭州310036；2.浙江省亚热带作物研究所，浙江温州325005；3.北京市农业广播电视学校平谷分校，北京101200）

甜菜夜蛾P450基因的克隆及组织特异性分析

郑笑笑1，魏 苹1，赵丽娜1，王世贵1，党向利2，张秋伶3，唐 斌1

（1.杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江杭州310036；2.浙江省亚热带作物研究所，浙江温州325005；3.北京市农业广播电视学校平谷分校，北京101200）

为获得甜菜夜蛾Spodoptera exigua（Hübner）P450基因序列并分析其分布的组织特异性，采用同源克隆结合RACE技术克隆得到了该基因的cDNA全序列：全长2 565 bp，包含1 010 bp的3′非编码区域和42 bp的5’非编码区域，开放阅读框（ORF）长1 515 bp，编码504个氨基酸，分子量为57.74 kD，理论等电点为8.01；包含2个糖基化位点，2～21 aa为跨膜结构.同源比对结果表明，SeP450与其它昆虫的P450基因拥有同样的2个保守结构域：CAFG、AG＼ET.SeP450与棉铃虫蛾Helicoverpa armigera P 450同源性最高，达74%；系统发育分析也表明二者亲缘关系较近.同时RT－PCR结果显示SeP450mRNA在中肠、脂肪体等多种组织中都有表达，其中中肠表达量最高.

甜菜夜蛾；细胞色素P450；基因克隆；序列分析

细胞色素P450广泛分布于不同生物中，从原始的细菌到高度发达的哺乳类体内均有，并参与多种代谢反应［1］.P450酶系是一类分子量在46～60 k Da［2］的蛋白质，它们的结构和性质类似［3］.研究发现，来源于不同种或同种不同品系、甚至是同一品系不同组织的P450，其在分子量、光谱特征、分布特征、免疫性质、氨基酸序列、调控机制及底物专一性等方面都是不尽相同的［4］，这种多样性使生物对多种多样的物质都具有代谢能力，也是P450基因对生物体整个生命活动重要性的体现［5］.归根结底，细胞色素P450拥有多样性的根本原因是其基因结构的多样性，而这种结构的多样性已从成功克隆测序的P450基因中得到证实［6］.同时，研究发现，除少数特例外，每一P450基因总是产生单一的P450蛋白.P450蛋白质种类的多样性及其底物的重叠性使P450酶系可以催化多种类型的反应，例如对许多外来物质如杀虫剂及其他环境有毒物质具有代谢作用［7］，这也是昆虫具有对杀虫剂的抗药性及对植物有毒物质耐受性的主要原因.同时P450蛋白质还参与一些起重要生理功能的内源性物质的代谢［8］，如参与昆虫体内激素的合成和代谢等［9］.P450分布的广泛性、催化机制和基因表达调控机制的多样性都体现出其强大的生物学重要性，因此可以预见P450的研究及应用势必会具有十分广阔的前景和意义［10］.

甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）是一种世界性顽固害虫，主要危害葱、豇豆、蕹菜、萝卜、白菜、莴笋、甘蓝、四季豆等作物，以百合科葱类危害损失最重［11］.本文从甜菜夜蛾P450基因的克隆入手，并对其表达特性加以分析，以期为深入研究分析其功能及探讨更加准确有效的农业害虫防治技术奠定基础.

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 甜菜夜蛾的饲养与材料收集 甜菜夜蛾由中山大学生命科学学院馈赠，在（26±1）℃、14 L∶10 D条件下室内连续多代饲养后作为试验材料.大肠杆菌Escherichia coli DH5α菌株由杭州师范大学动物适应与进化杭州市重点之重实验室保存.甜菜夜蛾成虫的解剖在冰上进行，解剖镜下观察并分离脂肪体等组织，分离放置于EP管后，迅速转移到－80℃中保存备用.

1.1.2 主要试剂 SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit、AMV RTase反转录酶、Taq DNA聚合酶和p MD18－T载体均购自宝生物工程（大连）公司；DNA纯化回收试剂盒购自Omega公司.

1.1.3 引物序列 根据已知昆虫P450基因cDNA序列的保守结构域，采用多重序列在线比对软件（http：／／multalin.toulouse.inra.fr／multalin／multalin.html）设计2对特异性引物：SeP450－3F1、SeP450－3F2和SeP450－3R1、SeP450－3R2，分别用于扩增甜菜夜蛾P450基因的5′和3′端序列.再根据2对引物获得的末端片段序列设计探针引物：SeP450－PFA，SeP450－PFB和SeP450－PFC（表1）.引物由上海英骏生物技术有限公司合成.

表1 P450基因cDNA扩增的引物序列Tab.1 Cloning primers for P450 cDNA

1.2 甜菜夜蛾总RNA的抽提

采用异硫氰酸胍法抽提甜菜夜蛾脂肪体等组织的总RNA.将100 mg新鲜的脂肪体组织放入小匀浆器中，加入500μL变性溶液D（4 mol·L－1异硫氰酸钠、25 mmol·L－1柠檬酸钠、0.1 mol·L－1巯基乙醇、0.5%十二烷基肌氨酸钠）充分匀浆；匀浆后转移至DEPC处理过的EP管中，加入50μL 2 mol·L－1乙酸钠溶液（p H4.0）、500μL p H7.0的饱和平衡酚和100μL氯仿／异丙醇（V（氯仿）∶V（异丙醇）＝49∶1）混合液，颠倒混匀；冰上放置15 min后，4℃12 000 r／min离心20 min；取上层水相至新的EP管中，加入等体积异丙醇混匀，－20℃放置1 h以上，4℃12 000 r／min离心15 min；沉淀重溶于100μL变性溶液D中，另加入10μL p H4.0的乙酸钠溶液和300μL乙醇混匀，－20℃放置1 h以上；4℃12 000 r／min离心15 min，将沉淀重溶于30～50μL的DEPC处理水中，－80℃冰箱长期保存.

1.3 cDNA的末端快速扩增（RACE）

根据Clontech公司（大连宝生物有限公司）的SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit试剂盒说明书，分别合成用于5′和3′－RACE扩增的cDNA.5′－RACE扩增采用试剂盒中的UPM通用引物和SeP450－5R1，巢式PCR时采用NUP和SeP450－5R2；3′－RACE扩增采用试剂盒中的UPM引物和SeP450－3F1，巢式PCR时采用NUP和SeP450－3F2.PCR扩增程序为：94℃10 min；94℃30 s，48℃30 s，72℃90 s，30个循环.SeP450－5R2和SeP450－3F2分别用于5′和3′－RACE的菌落PCR验证.

1.4 PCR产物的纯化及序列分析

在甜菜夜蛾P450基因的克隆中，利用巢式PCR引物SeP450－3F2和NUP及SeP450－5R2和NUP进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测分别获得了长约1 200 bp和2 000 bp大小的条带，将目的条带采用琼脂糖凝胶电泳回收后，连接到p MD18－T载体中，将其转入DH5α细胞，将验证后正确的转化子送上海英骏生物技术有限公司测序.序列分析和系统分析分别采用Dnastar、Vector、Compute pI／Mw、Clustal W和MEGA3.1等分析软件.

2 结果与分析

2.1 甜菜夜蛾P450基因的克隆和序列分析

将测序获得的2 565 bp基因片段翻译成氨基酸序列，并利用NCBI在线生物学软件BlastP对该序列进行同源性分析.结果显示，与鳞翅目昆虫的P450具有较高的同源性且与棉铃虫Helicoverpa armigera的同源性最高（74%），表明该基因为P450家族基因.根据该基因序列，分别在5′和3′端设计了2条特异性引物，PCR扩增获得了甜菜夜蛾P450基因的cDNA序列（GenBank登录号EJ524855），命名为Proex P450.该基因全长为2 565 bp，其ORF为1 515 bp，编码504个氨基酸，软件（http：／／expasy.org／tools／pi＿tool.html）分析并预测出该基因编码蛋白的分子量为57.74 k D，等电点为8.01.采用TMHMM Server 2.0和SignalP 3.0 Server在线分析，发现跨膜结构为2～21 aa之间，未发现信号肽序列.采用NetNGlyc分析发现ProexP450蛋白拥有2个N－糖基化位点，分别位于203～204 aa之间和250～251 aa之间（见图1）.

图1 甜菜夜蛾P450基因的核甘酸和氨基酸序列分析Fig.1 Nucleotide and amino acid sequences of P450 from S.exigua

2.2 昆虫的P450基因同源性和进化分析

查询NCBI数据库，并将已报道和登录的昆虫P450蛋白序列进行比对，结果发现昆虫的P450家族拥有2个非常保守的结构域：CAFG、AG＼ET.从不同目的昆虫中挑选代表性物种，用Multiple在线软件比对分析后发现，昆虫的P450蛋白不是特别保守，同源性在不同物种间差异很大（见图2）.

图2 不同目昆虫P450基因编码蛋白序列的比对Fig.2 Alignment of the deduced amino acid sequences of P450 gene in insects

甜菜夜蛾与其它昆虫P450蛋白序列的同源性结果如下：棉铃虫蛾H.armigera（AY950636）74%、玉米夜蛾H.zea（AF285830）72%、烟芽夜蛾H.virescens（AF140279）70%、野桑蚕B.mandarina（DQ252325）56%、家蚕B.mori（NM＿001112755）55%、意大利蜜蜂A.mellifera（NM＿001040234）38%、德国小镰B.germanica（AF281328）35%、丽蝇蛹集金小蜂N.vitripennis（XM＿001600233）36%、加拿大凤蝶P.canadensis（AF278603）54%、果蝇D.willistoni（XM＿002063174）36%、果蝇D.simulans（XM＿002080296）36%、黑腹果蝇D.melanogaster（NM＿078904）36%、果蝇D.sechellia（XM＿002032611）36%、果蝇D.yakuba（XM＿002089342）35%、冈比亚按蚊A.gambiae（AY193729）35%、豌豆蚜A.pisum（XM＿001944564）36%、赤拟谷盗T.castaneum（XM＿961344）33%、马铃薯甲虫L.decemlineata（DQ117463）35%、致倦库蚊C.quinquefasciatus（XM＿001847355）34%、埃及伊蚊A.aegypti（XM＿001653637）34%、北美黑凤蝶P.polyxenes（DQ365698）52%和北美黑条黄凤蝶P.glaucus（AF280615）53%.由上可知，在P450蛋白家族中，甜菜夜蛾与鳞翅目棉铃虫蛾的同源性最高（74%），与鞘翅目赤拟谷盗的同源性最低（33%）.

将已报道或登录的昆虫P450的蛋白序列进行系统进化分析，结果如图3所示.

图3 甜菜夜蛾P450基因与相关蛋白的系统进化分析Fig.3 System evolution analysis of P450 from S.exigua and other related proteins

可见在系统进化上，P450家族能很好地区分昆虫的不同分类阶元：鳞翅目与膜翅目、虱目的遗传距离较近，其次为双翅目和鞘翅目.昆虫包含了4个P450基因家族，分属于CYP4、CYP6、CYP9和CYP18家族，本次克隆获得的为CYP6B，属于CYP6家族.

2.3 甜菜夜蛾P450基因的组织分布

RT－PCR结果显示SeP450基因m RNA在脑、表皮、脂肪体、中肠、马氏管、卵巢、气管中均有表达，且主要分布在脂肪体、中肠和马氏管中，其中中肠含量最高（见图4）.

图4 甜菜夜蛾P450基因的组织分布Fig.4 Tissue distribution of SeP450 from S.exigua

3 讨 论

细胞色素P450于1958年被发现，由于其分布的广泛性、结构的多样性、功能的复杂性及基因的多层次调控性，一直受到人们的广泛重视.P450酶系在昆虫的生长、发育、取食等过程中起着十分重要的作用.但由于昆虫P450本身的特点，用生物化学方法来研究昆虫P450的结构和功能受到了一定的限制［1，6］.1982年Fujii－Kuriyama等克隆并测序得到肝的P450基因之后，P450基因的克隆及序列分析、影响其分布和合成的因素等成为研究的热点［12］.近代研究的一个主要焦点便是昆虫P450种类在异生化合物的解毒功能中所起的作用［13］.越来越多的昆虫P450基因被克隆和研究利用.

20世纪60年代，P450酶系因其在昆虫抗药性及昆虫对寄主植物适应性中的作用而受到重视.目前，NCBI中已有不少昆虫的P450基因序列，如鞘翅目的赤拟谷盗［14］，鳞翅目的家蚕［15］，双翅目的埃及伊蚊［16］、黑腹果蝇［17］，膜翅目的意大利蜜蜂［18］、丽蝇蛹集金小蜂［19］，虱目的人虱［20］等.至今有关昆虫P450酶系的研究已深入到分子水平［21］.昆虫的第一个P450c DNA是由Snyder和Davidson分离的，被定名为CYP4E1［22］.至今已鉴定的昆虫P450基因分属于8个基因家族（CYP4，CYP6，CYP9，CYP12，CYP15，CYP18，CYP28，CYP48），新的基因也还在被不断研究发现.P450基因不仅基因总数十分庞大，而且同一种生物中就存在多种，例如按蚊至少有17种［23］、果蝇有14种［24］.

为了研究和探讨P450在甜菜夜蛾的发育和解毒方面的作用，本研究首先以甜菜夜蛾脂肪体总RNA反转录成cDNA作为模板，PCR扩增获得其基因的全长cDNA序列，利用生物学软件对其与其他物种的同源性进行了分析.此外，还采用RT－PCR对该基因的组织分布特异性进行了研究.细胞色素P450虽然在许多组织或器官中存在，但其分布具有一定的特异性：主要分布在外源化合物进入体内所经过的主要入口的一些组织中，这些组织是针对经口皮进入的外源化合物的第一道防线.如在哺乳动物中，它主要分布于肺、皮肤、肠道、肝脏，这些都是氧化作用的重要场所；在鱼类中，主要分布于肾、肺和鳃；在昆虫中，主要分布于中肠、马氏管和脂肪体，而且中肠中的含量最高［25］.本研究结果与此一致.可见P450分布的特异性使其可以最大限度、最有效地发挥其生物学功能［26］.

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Cloning and Sequence Characteristics Analysis of P450 Gene from Spodoptera exigua（Lepidoptera：Noctuidae）

ZHENG Xiao－xiao1，WEI Ping1，ZHAO Li－na1，WANG Shi－gui1，DANG Xiang－li2，ZHANG Qiu－ling2，TANG Bin1
（1.College of Life and Environmental Science，Hangzhou Normal University，Hangzhou 310036，China；2.Zhejiang Institute of Subtropical Crops，Wenzhou 325005，China；3.Beijing agricultural radio and television school pinggu branch，Beijing 101200，China）

In order to obtain P450 gene sequence in Spodoptera exigua and analyze the tissue distribution，homology coloning and RACE were adopted to colone the cDNA of Spodoptera exigua P 450.The full length of cDNA with calculated molecular mass of 57.74 k D and pI of 8.01 is 2 565 bp，which includes an ORF of 1 515 nucleotides that encodes 504 amino acid residues and a 42 or 1 010 nucleotide for 5′－or 3′－non－coding region respectively.It has two glycosylation sites，the 2～21 aa is transmembrane structure.Homologous comparison results indicate that SeP450 contains two conservative domains the same as the P450 gene in other insects，including CAFG and AG＼ET.SeP450 shares 74%identity with that of Helicoverpa armigera，which is the highest and the phylogenetic analysis shows that the two species are most closely related.The result of RT－PCR show that SeP450 mRNA is expressed in midgut，fat body and other tissues，with the highest expression level in the midgut.

Spodoptera exigua；cytochrome P450；gene cloning；sequence analysis

S476.2；Q781

A

1674－232X（2012）03－0198－07

10.3969／j.issn.1674－232X.2012.03.002

2011－12－13

国家自然科学基金项目（31000880）；浙江省重点科技创新团队项目（2010R50039）；浙江省自然科学基金项目（Y3100176）；浙江省教育厅科研计划项目（Y201019137）；杭州师范大学优秀中青年教师支持计划项目（JTAS2011－01－031）；杭州师范大学生物科学国家特色专业本科生科技创新项目.

唐 斌（1980—），男，副研究员，博士，主要从事昆虫分子生物学和害虫生物防治相关领域研究.E－mail：tbzm611＠163.com