含纳米Au粒子的生物电极的制备及其生物电催化性能研究

梁媛媛

（杭州师范大学生物医药与健康研究中心，浙江杭州311121）

含纳米Au粒子的生物电极的制备及其生物电催化性能研究

梁媛媛

（杭州师范大学生物医药与健康研究中心，浙江杭州311121）

以壳聚糖为模板，采用柠檬酸为还原剂，通过原位负载方法制备了含有金（Au）纳米粒子的壳聚糖／Au／葡萄糖氧化酶（GOD）复合生物电极.利用扫描电镜对该生物电极的结构进行表征，结果显示Au纳米粒子的平均粒径为15 nm，均匀分布于壳聚糖膜内.将该复合电极用于葡萄糖的检测，结果发现GOD在复合膜中具有良好的生物催化活性，对葡萄糖有快速灵敏的响应，线性范围为0～30 mmol·L－1，线性相关系数大于0.998 8，检出限为32μmol·L－1（S／N＝3）.

壳聚糖；Au纳米粒子；葡萄糖氧化酶电极

0 前 言

化学与生物传感器因在临床分析、食品工业及环境监测领域中具有很大的应用潜力而日益受到关注.酶的高选择性及对底物的专一、快速响应使得酶电极成为研究最广泛的生物传感器.近年来，人们发现当用纳米材料对电极进行修饰时，不仅可将材料本身的理化性质引入电极界面，同时也会提高电极的比表面积，从而对某些物质的电化学行为产生特有的催化效应；另外还可以降低过电位，提高电化学反应速率以及电极的选择性和灵敏度等，能测定多种具有电活性和非电活性的物质［1－2］.金（Au）纳米粒子具有良好的生物相容性，并且具有良好的导电功能，将金纳米粒子引入到酶生物电级中可以促进酶与电极的电子转移，使得酶的活性中心与电极之间的直接电子转移成为可能［3］.壳聚糖（CHI）具有优异的成膜性、极强的吸附能力、良好的生物相性，使其在近年来成为固定生物分子的优良材料.由于其带有丰富的氨基，壳聚糖对纳米粒子具有特殊的吸附作用［4］，可作为纳米粒子原位形成的基质.

因此，本研究拟制备一种基于纳米Au／壳聚糖有机－无机复合膜作为固定基质的酶生物传感器.该复合膜具备高比表面积、对蛋白的高亲和作用以及有机基质壳聚糖成膜性好、膜机械强度高等一系列优点，能实现对酶的高负载与固定化，最终得到灵敏度高、响应速度快、稳定性好的生物传感器，并且此基质也可用于其它生物分子的固定.

1 实验部分

1.1 试剂

壳聚糖：上海晶纯试剂公司；葡萄糖氧化酶（GOD，EC 1.1.3.4，2.500 5μkat·mg－1）：上海博奥生物试剂公司；葡萄糖：上海国药化学试剂公司；氯金酸：Sigma公司；其他试剂均为分析纯试剂.

1.2 纳米Au粒子的制备

在10 m L质量分数为0.4%的壳聚糖醋酸溶液中加入0.5 mol·L－1的氯金酸100μL并混匀，在不断振摇下加入1 mol·L－1的柠檬酸溶液200μL，溶液逐渐转化为溶胶，所制备的纳米Au溶胶的颜色为粉红色，在室温下静置反应2 h，备用.

1.3 含纳米Au粒子的CHI／Au／GOD复合电极的制备

用微量取样器吸取5μL上述Au溶胶并涂滴于光洁的玻碳电极表面，在室温下晾干后将玻碳电极放入p H 7.0的PBS溶液中浸泡过夜.然后，将5μL GOD溶液（p H＝7.0，5 mg·m L－1）滴涂在Au纳米粒子层上，置入4℃冰箱中晾干，备用.所得传感器的表面形貌用扫描电子显微镜（AUM，1 530VP，德国LEO公司）表征，传感器的电化学测试在CHI630A电化学工作站（上海辰华公司）上进行（24℃恒温），采用的三电极系统由铂丝对电极、饱和甘汞参比电极以及制备的GOD传感器工作电极构成，0.02 mol·L－1PBS为电解液.

图1 CHI／Au／GOD复合电极的表面微结构Fig.1 SEM micrographs of CHI／Au／GOD

2 结果与讨论

2.1 Au纳米粒子的结构与表征

壳聚糖长链的存在可以控制Au纳米粒子的生长，防止纳米粒子之间相互作用发生团聚，有利于生物电极具有良好的导电功能以及酶分子的均匀负载.图1是CHI／Au／GOD复合膜的扫描电镜图，从图中可以看出Au纳米粒子均匀地分散于基质中，粒径为15 nm左右.

2.2 含纳米Au粒子的CHI／Au／GOD电极的电化学行为

图2a显示了CHI／Au／GOD复合膜修饰电极在K4Fe（CN）6的PBS缓冲溶液中（0.02 mol·L－1，p H 7.0）不同扫描速度下的循环伏－安曲线.从图中可知，在－0.2～0.6 V范围内均有一对可逆的氧化还原峰出现，扫描速度为100 m V· s－1时，其势电位为标准式量电位即E1／2为0.27 V（vs SCE），与铁氰化钾标准式量电位相近，表明该峰对应铁氰化钾的特征氧化－还原反应.阴极电流和阳极电流的比值为0.996，说明该电极反应具有良好的可逆性和快速的电子传递特性.

随着扫描速度从25 m V·s－1增加到300 m V·s－1，氧化还原峰电流与扫描速度成正比（图2 b），表现出表面控制反应过程.已知在薄层循环伏安电化学中，对循环伏安还原峰进行积分，可以得到薄膜中的电活性物质在电极发生还原时所消耗的电荷Q.将其代入法拉第公式Q＝n FAΓ＊，就可以得到电活性物质的表面浓度（Γ＊，mol·cm－2），这里的n代表电活性物质发生电极反应时的电子转移数，F为法拉第常数，A为电极面积（cm2）.由此可以估算出薄膜中GOD的表面浓度为3.52×10－9mol·cm－2，而当GOD为单分子层吸附时其表面浓度的理论值为1.7×10－12mol·cm－2［5］，这说明Au纳米粒子在复合膜中是多层吸附的.

图2 CHI／Au／GOD电极在1.0 mol·L－1K4Fe（CN）6的PBS（0.02 mol·L－1，p H 7.0）溶液中的电化学行为Fig.2 The electrochemical behavior of CHI／Au／GOD in 0.02 mol·L－1PBS（pH 7.0）containing 1.0 mmol·L－1K4Fe（CN）6

图3所示为利用循环伏安法考察所得CHI／Au／GOD复合膜修饰电极对葡萄糖的电催化性质.当溶液中加入葡萄糖后，可以观察到氧化还原峰发生了明显的变化，表现为氧化峰增强、还原峰减弱，具有典型的电催化特性，表明固定在电级上的GOD具有良好的生物活性，在K4Fe（CN）6的作用下，能可逆地进行氧化还原反应，其催化原理可用下式表达：其中，GO（FAD）和GO（FADH2）分别为葡萄糖氧化酶的氧化型和还原型；G和GL分别代表葡萄糖和葡萄糖酸内酯.即扩散入膜的G被GOD氧化生成GL，GOD本身也从GO（FAD）转化为GO（FADH2）（式2）.此时，还原型的GO（FADH2）被溶液中的［Fe（CN）6］3－氧化（式3），再次转化为GO（FAD）.［Fe（CN）6］4－进一步在电极表面失去电子，产生氧化电流（式1）.通过这一过程，GOD上的电子成功地传递到电极上，其本身在反应过程中得到再生，可以用来连续催化葡萄糖的氧化，得到氧化峰增强、还原峰减弱的催化循环伏安图.

图4为在PBS（0.02 mol·L－1，p H7.0）溶液中CHI／Au／GOD复合膜修饰电极响应电流随葡萄糖浓度的变化曲线.从图中可以看出，当葡萄糖浓度低于30 mol·L－1时，与电流值的增量成线性关系，线性回归方程为Ip（μA）＝0.097C（mmol·L－1）＋2.565（R＝0.998 8），检出限是32μmol·L－1（S／N＝3）.当葡萄糖浓度较低时，电极的稳态响应电流和葡萄糖浓度呈线性关系.当葡萄糖浓度较大时，响应电流和葡萄糖浓度无关，符合Michaelis－Menten的动力学关系.根据Lineweaver－Burk方程［6］：

1／Iss＝1／Imax＋Kampp／（Imaxc），

式中，Iss为加入一定底物浓度时的稳态电流，Imax为底物达到饱和时的最大（极限）电流，c为与Iss对应的底物浓度.以1／Iss对1／c作图，由其截距和斜率即可求得米氏常数Kampp为10.2 mmol·L－1，与文献报道值接近［7］，说明GOD在复合膜中保持了良好的生物活性.

3 结 论

本文通过原位负载法获得了CHI／Au／GOD复合膜修饰电极，Au纳米粒子的平均粒径为15 nm，均匀分布于壳聚糖膜内，GOD的表面浓度为3.52×10－9mol·cm－2，呈多层吸附状态；该电极反应具有良好的可逆性和快速的电子传递特性，将其用于溶液中葡萄糖的检测，结果表明该修饰电极对葡萄糖有快速灵敏的响应，线性范围为0～30 mmol·L－1，线性相关系数大于0.998 8，检出限为32μmo L·L－1（S／N＝3）.本工作的开展为葡萄糖检测提供了一种新型的基于生物电催化性能的传感器，也拓宽了纳米颗粒在生物传感器中的应用前景.

［1］姜灵彦，刘传银，蒋丽萍，等.纳米材料修饰电极及其在电分析化学中的应用［J］.化学研究与应用，2004，16（5）：615－618.

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［3］Murray R W.Nanoelectrochemistry：metal nanoparticles，nanoelectrodes，and nanopores［J］.Chemical Reviews，2008，108（7）：2688－2720.

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Research on the Preparation and Bioelectrocatalysis Property of Bioelectrode with Au Nanoparticle

LIANG Yuan－yuan
（Research Center of Biomedicine and Health，Hangzhou Normal Universtiy，Hangzhou 311121，China）

The chitosan／Au／glucose oxidase electrode complex bioelectrode with Au nanoparticles was prepared by the in－site supported method with chitosan as the formwork as well as citric acid as the reducing agent.Characterizing the structure of the bioelectrode with the scanning electron microscope，the results show that the mean diameter of the Au nanoparticles is about 15 nm，which distribute evenly in the chitosan.Detecting glucose with the bioelectrode，the results show that GOD has favorable biocatalysis activity in complex film as well as rapid and sensitive response to glucose，the linear range is 0 to 30μmol·L－1，the correlated coefficient is greater than 0.998 8，and the detection limit is 32μmol·L－1（S／N＝3）.

chitosan；Au nanoparticles；glucose oxidase electrode

0657.14

A

1674－232X（2012）03－0222－04

10.3969／j.issn.1674－232X.2012.03.006

2011－12－14

杭州市科技计划发展项目（KH10364）；杭州师范大学科研启动项目（PD10002004001040）.

梁媛媛（1980—），女，助理研究员，博士，主要从事多功能纳米复合材料研究.E－mail：liangyy＠hznu.edu.cn