p53RFP表达载体的构建及其对HEK293A细胞增殖的抑制作用

裴静娴，王月刚，张艺军，赖文岩，吴平生

（1.南方医科大学南方医院心内科，广州 510515；2.广州军区广州总医院干部病房二科，广州 510010）

p53RFP是新发现的一个受p53转录调控的基因，其产物具有E3泛素连接酶活性，通过泛素化降解凋亡重要启动信号p21WAF1，参与细胞增殖和凋亡，从而参与细胞周期的调控［1～3］。本研究拟构建p53RFP的表达载体，通过观察其对细胞生长的影响，初步了解其生物学功能。

1 材料与方法

1.1 材料

HEK293A细胞（美国Invitrogen公司），SW620细胞（本研究室冻存）；DMEM培养基、胰蛋白酶（美国Gibco公司）；胎牛血清（德国PAA公司）；pcDNA4/Myc-HisA、LipofectamineTM2000质粒中提试剂盒（美国Invitrogen公司），KOD-Plus-Neo（日本Toyobo公司）；限制性内切酶HindⅢ、EcoRⅠ（加拿大Fermentas公司）；T4 连接酶、DNA marker、RNAiso Plus、逆转录试剂盒（日本Takara公司）；胶回收试剂盒、DNA纯化试剂盒、质粒小提试剂盒（美国Biomiga公司）；荧光定量PCR试剂盒（美国Roche公司）；大肠杆菌DH5α为本室冻存菌种；BCA蛋白质定量测定试剂盒（上海申能博彩公司）；鼠抗人β-actin单克隆抗体（美国Santa Cruz公司），鼠抗人p53RFP单克隆抗体（台湾Abnova公司），山羊抗小鼠辣根过氧化物酶标记二抗（HRP-labeled goat anti-mouse IgG，北京中杉金桥公司）；PVDF膜（美国Millipore公司）；ECL发光试剂盒（美国Pierce公司），CCK-8试剂盒（日本Dojindo公司）。

1.2 方法

1.2.1 p53RFP表达载体的构建及鉴定：37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养SW620细胞48 h，用RNAiso Plus试剂提取细胞总RNA。逆转录合成cDNA。根据p53RFP基因CDS区序列设计引物，引入限制性内切酶HindⅢ和EcoRⅠ的识别位点，上游引物：5′CATCTGGACCCCTACCGAACA3′，下游引物：5′ACACGAGCAGAATTTCAGGTG3′。PCR 扩增p53RFP编码序列，反应体系为50 μL：10×PCR缓冲液 5 μL，dNTP 5 μL，Mg2+3 μL，上下游引物（10 μmol）各 1.5 μL，cDNA 模板 2 μL，KOD-Plus-Neo 1 μL。PCR 反应条件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 10 s，55 ℃30 s，68℃1 min 20 s，共32个循环；68℃延伸 3 min。取PCR纯化产物和pcDNA4/Myc-HisA质粒分别行HindⅢ和EcoRⅠ双酶切，回收大片段，加T4连接酶16℃水浴过夜。连接产物转化感受态DH5a，将转化产物均匀涂布于含有100 mg/L氨苄青霉素的LB选择平板上倒置培养过夜。筛选2～3个菌落，摇菌后取1 μL进行PCR扩增鉴定；小量提取质粒DNA，进行HindⅢ和EcoRⅠ双酶切鉴定，将双酶切鉴定正确的质粒送英骏公司测序。

1.2.2 p53RFP表达载体转染HEK293A细胞：以含5%胎牛血清的DMEM培养基培养HEK 293A细胞，转染前1 d细胞传代。将5×105细胞接种于6 cm培养皿，使转染时细胞汇合率在80%以上。以Opti-MEM 250 μL分别稀释 pcDNA4-p53RFP质粒约 5 μg和 10 μL LipofectamineTM2000。转染 4 h 后更换新鲜培养基。

1.2.3 RT-qPCR检测转染后p53RFPmRNA表达水平：pcDNA4-p53RFP转染HEK293A细胞24 h，提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，以cDNA为模板行PCR，反应条件：95 °C 10 min；95 °C 10 s，60 °C，30 s，40个循环。引物序列如下：p53RFP：上游引物5′CATCTGGACCCCTACCGAACA3′，下游引物 5′ACA CGAGCAGAATTTCAGGTG3′；β-actin：上游引物 5′CAAATGCTTCTAGGCGGACTATG3′，下游引物 5′TGCGCAAGTTAGGTTTTGTCA3′。

1.2.4 Western blot检测转染后p53RFP蛋白表达水平：pcDNA4-p53RFP转染HEK293A细胞48 h，提取细胞总蛋白。将蛋白加入6×loading buffer，100°C煮沸5 min。取30 μg总蛋白上样，行12%SDS-PAGE电泳，200 mA 70 min转印至PVDF膜，依次5%脱脂牛奶封闭，一抗（p53RFP 1︰600稀释，β-actin 1︰1 000稀释）孵育过夜，TBST漂洗（10 min×3次），二抗（1︰10 000稀释）室温孵育1 h，TBST漂洗（10 min×3次），ECL发光。

1.2.5 细胞增殖活力检测（cell couning kit-8，CCK-8）p53RFP过表达对HEK293A细胞增殖的影响：接种 HEK293A 细胞于 6孔板（3×105～4×105/孔），24 h后转染pcDNA4-p53RFP，空载体转染组做阴性对照，空白组不做任何处理。转染4 h后更换为新鲜培养基。12 h后消化为单细胞悬液，以每孔2 000个细胞接种于96孔板，每组6个复孔。于转染后24 h、48 h、72 h 及 96 h，向培养孔加入 10 μL CCK-8 溶液，在培养箱中孵育3 h，用酶标仪检测450 nm的吸光度值。

1.3 统计学分析

应用SPSS 13.0统计软件，采用One-way ANOVA检验比较不同处理组p53RFPmRNA表达水平，及不同处理组对HEK293A细胞增殖水平是否具有统计学差异。当方差分析差异有统计学意义，且方差齐性时，采用LSD法行多重比较，方差不齐时采用Games-Howell检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 p53RFP基因克隆

所要扩增的p53RFP基因的长度为912 bp，RTPCR的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示，条带大小与理论值一致，表明成功扩增出p53RFP基因。见图1。

2.2 pcDNA4-p53RFP质粒酶切及测序鉴定

pcDNA4-p53RFP质粒经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后，取5 μL酶切产物行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示：可见载体片段（5.1 kb）和目的片段（912 bp），表明载体连接成功。

2.3 RT-qPCR检测p53RFPmRNA表达

RT-qPCR检测结果显示：pcDNA4-p53RFP转染组p53RFPmRNA相对表达量（34739.440±1382.572）显著高于空白组（0.980±0.020）及空载体转染组（0.837±0.101）（P 均<0.01），表明 pcDNA4-p53RFP转染HEK293A后可在细胞内高表达。

2.4 Western blot检测p53RFP蛋白表达

Western blot结果如图3所示：pcDNA4-p53RFP转染组p53RFP蛋白表达水平上调，提示pcDNA4-p53RFP转染HEK293A细胞可大量表达p53RFP蛋白。

2.5 转染后各组细胞增殖水平

CCK-8检测结果如图4所示：与阴性对照组相比，pcDNA4-p53RFP转染组转染后72 h、96 h细胞增殖受到明显抑制（P均<0.01）。

3 讨论

p53RFP是新近发现的调控细胞增殖和细胞周期的重要基因［1］，目前对该基因的研究较少。对其生物学活性的认识主要停留在它作为p53下游靶基因参与的细胞凋亡过程方面。为研究p53RFP的生物学功能，本研究成功构建了p53RFP的表达载体，并将其转染至HEK293A细胞。结果发现：转染后，p53RFP可在HEK293A细胞高效表达，并可抑制HEK293A细胞的增殖。据文献报道，p53RFP作为p53诱导的泛素连接酶，可能通过泛素化降解凋亡的重要启动信号p21WAF1参与细胞周期的调节［1］。而p53RFP是否可以直接调控细胞周期蛋白，从而影响细胞增殖，尚有待于进一步研究。

泛素—蛋白酶系统在生理及病理生理条件下可发挥多种重要作用。真核细胞内约80%的蛋白都是通过泛素—蛋白酶系统降解。E3泛素连接酶是泛素—蛋白酶系统特异性的重要成分，决定泛素介导的蛋白酶体降解途径底物的特异性［4］。大多数E3泛素连接酶属于RING结构域家族，其最典型的特点是具有环指结构域，该结构是此家族具有泛素连接酶作用的重要因素。具有环指结构域的E3泛素连接酶参与调节很多重要的细胞功能，如细胞周期、DNA修复、细胞信号转导及对低氧的反应［5～9］。p53RFP包含氮端的RING-IBR-RING结构域和碳端保守结构域，研究发现氮端的RING-IBR-RING结构域决定其产物具有E3泛素连接酶活性，碳端的保守结构域也可能具有重要的功能［3］。目前，对于p53RFP基因的功能研究较少，p53RFP的功能及其作用机制尚待进一步阐明。因此，本研究构建的p53RFP表达载体为进一步研究p53RFP的生物学功能奠定了基础。

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