LC－MS法测定苦参总碱片中3种生物碱的含量

朱燕萍 王 军 陕西中医学院附属医院药剂科 （咸阳 712083）

苦参中含有多种有效成分，苦参总碱为其主要药效成份，具有抗心律失常、抗病毒、抗肿瘤、升白细胞的功效。能改善心肌细胞的离子转运，降低心肌应激性，使心率变慢，传导延长，心肌兴奋性降低，与目前临床广泛应用的抗心律失常药相比，具有高效，无毒、副作用少的特点［1］。苦参总碱片收载于黑龙江省药品标准及卫生部中药成方制剂标准，用苦参总碱浸膏经加工制成的中药片剂，用于各种原因引起的心律失常，对室性早搏疗效尤为显著。我们建立了LC－MS法，检测该制剂主要成分苦参碱、氧化苦参碱和槐果碱的含量，为其药品标准修订提供参考。

1 仪器与试药 美国Agilent公司1100HPLC／MSD高效液相色谱／质谱联用仪。含在线脱气机、双高压梯度泵、自动进样器、柱温箱、电喷雾离子源、四极质谱检测器、Agilent化学工作站。氧化苦参碱、苦参碱和槐果碱（供含量测定用，由中国药品生物制品检定所提供）；苦参总碱片（由黑龙江龙桂制药有限公司提供）。甲醇：色谱纯，Merck公司；乙酸铵：分析纯，南京化学试剂厂；氯仿：分析纯，南京化学试剂厂；试验用水均为Milli－Q超纯水机制备。

2 方法与条件 2.1 色谱条件 色谱柱：VPODS柱，150mm×2.1mm（ID），5μm（岛津）。柱温：25℃。流动相：0.01mol·L－1乙酸铵水溶液：甲醇＝12：88；流速：0.2mL·min－1。电喷雾离子源参数：喷雾电压为4000V；干燥气为氮气，流速10L·min－1；喷雾压力40psi；温度350℃；裂解器电压：120V。离子化方式：电喷雾离子化，正离子方式；选择离子检测（SIM）：槐果碱 m／z 247.1，苦参碱 m／z 249.2，氧化苦参碱m／z 264.9。

2.2 供试品溶液的制备［2］取苦参总碱片10片（每片100mg），除去包衣后，精密称定、研细，精密称取适量，约相当于苦参总碱100mg，置具塞锥形瓶中，加浓氨试液0.5mL，精密加入三氯甲烷100mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率33kHz）30 min，放冷，再称定重量，用三氯甲烷补足减失的重量，摇匀滤过。滤液通过中性氧化铝柱（100～200目，8 g，内径1cm），用三氯甲烷洗脱2次，每次100mL，收集洗脱液，回收溶剂至干，残渣加甲醇适量使溶解，并转移至100mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0·45μm）滤过，精密量取滤液5mL，置50mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，做为供试品溶液。

2.3 对照品溶液的制备 分别精密称取苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱对照品各5mg，分置25mL量瓶中，分别加甲醇适量，振摇使溶解，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，做为对照品储备液备用，精密量取储备液各2.5mL，置25mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品工作液。

2.4 线性关系的试验 精密吸取不同量的氧化苦参碱、苦参碱、槐果碱对照品工作液适量，分别配成苦参碱浓度为100，200，1000，2000，8000，16000ng·mL－1；氧化苦参碱浓度为 200，400，2000，4000，20000，60000ng·mL－1；槐果碱浓度为50，100，200，500，2000，8000ng·mL－1，各进样10μL，记录峰面积，以对照品溶液浓度（C）与其相应峰面积（Y），求回归方程；结果表明苦参碱在（100－16000）ng·mL－1范围内线性关系良好，回归方程：Y＝84215C＋1E＋07，r＝0.9999；氧化苦参碱在（200－60000）ng·mL－1范围内线性关系良好，回归方程：Y＝26542C＋1E＋07，r＝0.9998；槐果碱在（50－8000）ng·mL－1范围内线性关系良好，回归方程：Y＝100892C＋3E＋06，r＝0.9997。

2.5 精密度考察 取同一份对照品溶液，进样量10μL，重复进样5次，测定峰面积，结果表明苦参碱RSD为0.97%，氧化苦参碱RSD为0.56%，槐果碱RSD为0.89%，说明本法精密度良好。

2.6 重复性考察 取同一批供试品，按供试品溶液制备方法制备5份供试液，测定苦参碱、氧化苦参碱和槐果碱含量。结果苦参碱RSD为1.02%，氧化苦参碱RSD为0.95%，槐果碱RSD为1.12%，说明本法具有良好重复性。

2.7 回收率试验 采用加样回收法，取已知含量的苦参总碱片，分别加入苦参碱，氧化苦参碱，槐果碱对照品，按上述色谱条件测定，并计算平均回收率。平均回收率分别为：99.2%、98.6%和98.9%。

2.8 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0，2，4，6，8h测定苦参碱、氧化苦参碱和槐果碱的峰面积，结果苦参碱RSD为0.83%，氧化苦参碱RSD为0.75%，槐果碱RSD为0.91%，表明制备的供试液在8h内稳定。

2.9 供试品的测定 对照液和供试品溶液各10μL进样，按上述色谱条件测定，采用峰面积外标法计算含量。三批供试品（100mg）的测定结果如下：

表1 样品测定

3 讨 论 苦参总碱片中主含苦参生物碱类成份，氯仿加浓氨溶液提取法为传统的提取方法，分离苦参中的生物碱类物质，文献报道的HPLC法大都采用氨基柱和硅胶正相柱［3，4］，其流动相系统复杂且重复性不佳，经过反复试验考察，最后确定采用的色谱柱为VP－ODS柱，2.1mm×150mm，5μm。流动相系统采用的是挥发性乙酸铵和甲醇系统，可用于HPLC／MS分析，上述色谱系统中，3种苦参生物碱色谱行为较佳，保留时间适中，在本实验所采用的提取条件下能提取完全。

中药及其复方制剂的化学成分复杂，以单一成分控制其质量显然有些不足和滞后，从单一成分指标测定到多成分指标的同时测定来分析中药成分，是中药质量控制的变化趋势。［5］。本试验采用LC－MS法同时测定苦参总碱片中苦参碱、氧化苦参碱和槐果碱的含量，线性关系良好，重复性及回收率试验均符合要求，该方法快速、灵敏、稳定，适合作该制剂的含量测定方法。

［1］赵 敏，金玄俊，邢武军.苦参总碱治疗心律失常50例疗效分析［J］.心血管康复医学杂志，1999，8（3）：58－59.

［2］赵焕霞.苦参片中苦参碱和氧化苦参碱的含量测定［J］.中国实验方剂学杂志，2008，14（2）：13－14.

［3］金莉霞，崔燕岩，章观德.苦参生物碱的高效液相色谱法测定［J］.药学学报，1993，28（2）：136－139.

［4］崔建芳，章观德，王幕邹.苦参与苦豆子中生物碱的高效液相层析法与薄层光密度法测定［J］.药学学报，1985，20（1）：59－66.

［5］曹伶俐.苦参及其制剂的质量控制研究进展［J］.陕西中医，2010，31（10）：1410－1411.