加味四逆散对肝星状细胞增殖的实验研究＊

郑旭锐 李长秦 季金文 王礼凤 孙守才 宋 健 王小平 肖新春 陕西中医学院（咸阳 712046）

加味四逆散是抗肝纤维化有效的中药复方，我们在前期的研究中已经证实其具有良好的抗肝纤维化作用［1－5］，为了进一步探讨其抗肝纤维化的机制，我们此次以肝星状细胞（HSC）为靶点，研究该方对HSC增殖的影响。

1 实验材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 实验动物：雌性SD大鼠30只，清洁级，体重180g±20g，购自第四军医大学实验动物中心。动物合格证号：SCXK－（军）2007－007。

1.1.2 主要实验药物：加味四逆散：柴胡、枳壳、桃仁各10g，白芍20g，姜黄30g，丹参25g，黄芪40g。以上药物均购自陕西中医学院附属医院中药房，药物经加水浸泡，常规煎煮，过滤，水浴蒸发至3.12g／mL浓度的药液；复方鳖甲软肝片：0.5g／片，批号：20100808，用蒸馏水溶解至0.625g／mL。

1.1.3 动物细胞：HSC－T6（大鼠肝星状细胞）：购自上海肯强仪器有限公司，编号zy1002。

1.1.4 主要试剂：RPMI－1640干粉培养基（美国Gibco公司，按每10.4g 1640干粉培养基溶于900mL双蒸水，待其分溶解，加入青霉素100U／mL，硫酸链霉素I00U／mL，用1mol／L NaOH调节PH至7.1～7.4，定容至1000mL，采用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后于4℃冰箱保存）；胰蛋白酶（美国Sigma，进口分装，浓度为1：250，即0.25%，用胰蛋白酶0.25g，PBS100mL，充分溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后于4℃冰箱保存。临用时用无菌的7.4%NaHCO3调节PH至7.2左右）；胎牛血清（FBS，郑州益康生物工程有限公司）；二甲基亚枫（DMSO，美国Sigma公司）；四甲基偶氮唑蓝（MTT，美国Sigma公司）

1.1.5 主要仪器：二氧化碳培养箱（德国Bind CB－150）；电子精密天平（BS124S型，北京赛多科斯仪器系统有限公司）；超低温冰箱（美国热电702型）；全自动酶标仪（美国Bio－Tek ELX808IU）。

1.2 实验方法 1.2.1 分组：将30只实验大鼠适应性喂养1周后随机分为5组：空白对照组；加味四逆散低浓度组；加味四逆散中浓度组；加味四逆散高浓度组；复方鳖甲软肝片组，每组均6只。

1.2.2 制备含药血清：空白对照组每只按1mL／100g给予生理盐水灌胃，1次／d；加味四逆散低浓度组每只按1mL／100g（每毫升含生药量0.78g）灌胃，1次／d；加味四逆散中浓度组每只按1mL／100g（每毫升含生药量1.56g）灌胃，1次／d；加味四逆散高浓度组每只按1mL／100g（每毫升含生药量3.12g）灌胃，1次／d；复方鳖甲软肝片组每只按1mL／100g（每毫升含生药量0.625g）灌胃，1次／d；以上各组大鼠均连续灌胃7d。最后一次灌药（灌药前禁食不禁水12h）1h后，每只大鼠按0.35mL／100g给予10%水合氯醛进行麻醉，腹主动脉采血，离心分离血清，56℃水浴中灭活30min，0.45um微孔滤膜过滤，－20℃冷藏备用。

1.2.3 细胞培养及传代：HSC－T6以含10%胎牛血清的RPMI－1640培养于含5%CO2、饱和湿度为37℃环境中。RPMI－1640中含100U／mL青霉素、100U／mL硫酸链霉素，每2d传代1次。培养方法：本实验的HSC－T6是原代细胞，将HSCT6细胞于37℃快速复苏，常规0.4%台昐蓝拒染法进行细胞活力鉴定，细胞计数调节成（0.5～1）×105／L的浓度并接种在100mL培养瓶中，于5%CO2、饱和湿度的二氧化碳培养箱里培养1～3d，当细胞完全贴壁后换液，以后每3～4d换1次培养液。每隔4～8h用显微镜观察细胞形态及生长状态。

当细胞生长至80%左右汇合后传代，吸取全部细胞培养液，PBS洗1～2次，滴加37℃预热的0.25%胰蛋白酶1～2mL，以液面覆盖细胞为宜。转动培养瓶，使胰酶铺满培养瓶底，显微镜下观察胞质回缩，胞间间隙增大时快速吸取胰酶，滴加5mL培养液，终止消化，反复轻柔吹打10～15次，使成单细胞悬液，以1∶2或1∶3稀释后传代，培养24h换液，48h再次传代。

1.2.4 MTT比色法检测药物对HSC－T6增殖的影响：取对数生长期HSC－T6，调节细胞浓度为2×104个细胞／mL，将调整浓度后的细胞接种于96孔培养板，培养12h；细胞贴壁后，吸弃原培养液，分组加入药物血清。空白对照组加入生理盐水大鼠血清0.5mL；加味四逆散低浓度组、加味四逆散中等浓度组、高浓度组分别加入不同浓度加味四逆散大鼠药物血清0.5mL；复方鳖甲软肝片组加入鳖甲软肝片大鼠药物血清0.5 mL；以上各组每组设6个复孔，处理12h、24h、48h。每孔加入5mg／mL的MTT液20μL，37℃继续培养4h后，小心吸出上清液，每孔加入DMSO150μL混均，震荡10min使紫蓝色沉淀充分溶解，用酶标仪（ELX808IU型）在490nm波长检测各孔吸光度值（OD值）。以上实验重复3次，求平均值；抑制率＝（1－实验组平均OD值／对照组平均OD值）×100%，计算抑制率。

1.2.5 统计学方法：采用SPSS13.0统计软件，计量资料以均数±标准差表示，多个样本的比较采用单因素方差分析，多个样本的两组间比较采用SNK－q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果 不同浓度加味四逆散药物血清作用生长良好的肝星状细胞12h、24h、48h后，MTT比色法显示随加味四逆散含药血清浓度的增加，HSC490nm波长处吸光度值（OD值）逐渐降低，抑制率上升，呈现量效与时效关系。药物组细胞抑制率明显高于空白对照组（P＜0.01）；加味四逆散低、中、高浓度组与鳖甲软肝片组相比较，除低、中浓度组作用12h、24h时无差异（P＞0.05）外，其余浓度组均优于鳖甲软肝片组，差异有统计学意义（P＜0.05）。细胞490nm波长处吸光度值与加味四逆散作用时间和浓度的关系，见表1。

表1 不同浓度加味四逆散药物血清对HSC增殖的影响（）

表1 不同浓度加味四逆散药物血清对HSC增殖的影响（）

注：与空白对照组比较，△P＜0.01；与鳖甲软肝片组比较，▲P＜0.05，◇P＞0.05

3 讨 论 不同病因导致肝纤维化的共同途径是肝星状细胞（HSC）的激活，HSC转化为肌成纤维细胞，合成大量的细胞外基质（ECM），ECM在肝内大量沉积，导致肝纤维化形成。有报道人HSC活化增殖时Ⅰ型胶原mRNA为静止时的60～70倍［6］，故 HSC活化增殖是肝纤维化发生的细胞学基础［7］，HSC活化增值是肝纤维化形成的中心环节。体外培养的HSC可自发活化，目前是体外研究药物抗肝纤维化较为理想的模型。我们此次以HSC为靶点，用中药复方加味四逆散药物血清为干预因素，研究该药对肝星状细胞增殖的影响。

复方鳖甲软肝片在临床上用于治疗HF已经得到公认，并且体外研究已明确其对肝纤维化早期有明显阻断作用，并可抑制HSC活化、增殖及ECM的形成，从而阻止慢性肝病肝纤维化的发生和进展［8］。因此我们选用复方鳖甲软肝片作为阳性对照组。

本研究用MTT检测法观察加味四逆散含药血清对HSC增殖的影响，吸光度值能间接反映活细胞的数量，结果表明加味四逆散含药血清能显著抑制HSC增殖，随作用浓度的增加和作用时间的延长，490nm波长处吸光度值逐渐降低，抑制率上升，呈现量效和时效关系。实验组细胞抑制率明显高于空白对照组（P＜0.01）；加味四逆散低、中、高浓度组与鳖甲软肝片组比较，除低、中浓度组作用12h、24h时无差异（P＞0.05）外，其余浓度组均优于鳖甲软肝片组，差异有统计学意义（P＜0.05）。本研究结果提示加味四逆散可以抑制HSC增殖，这可能是其抗肝纤维化的途径之一。

［1］李长秦，胡建军，郑旭锐，等.加味四逆散对肝纤维化大鼠肝组织ⅠⅢ型胶原含量的影响［J］.陕西中医，2004，25（9）：852－854.

［2］李长秦，郑旭锐 孙守才，等.加味四逆散肝纤维化大鼠肝组织Ⅳ型胶原和转化生长因子β1影响的免疫组化研究［J］.云南中医学院学报，2004，27（3）：25－27.

［3］郑旭锐，孙守才，李长秦.加味四逆散治疗肝纤维化量效关系实验研究［J］.吉林中医药，2008，28（5）：25－27.

［4］郑旭锐，孙守才，韦永红，等.加味四逆散对肝纤维化大鼠肝组织Ⅰ，Ⅲ型胶原mRNA影响的研究［J］.时珍国医国药，2007，18（8）：1923－1924.

［5］郑旭锐，孙守才，李长秦，等.加味四逆散对肝纤维化大鼠肝组织TGFβ1、CTGFmRNA影响的研究［J］.时珍国医国药，2009，20（10）：2597－2598.

［6］董培红，何生松，苏 刚，等.内毒素对大鼠肝星状细胞活化和瘦素表达的影响［J］.现代中西医结合杂志，2006，15（2）：156－158.

［7］Iredale JP，Benyon RC，Pickering J，et al.Mechanisms of spontaneous resol－Ution of rat liver fibrosis.Hepatic stellate cell apoptosis and reduced hepaticexpression of metalloproteinase inhibitors.J Clin Ivest，1998，102：538－549.

［8］赵景明，周光德，李文淑，等.复方鳖甲软肝片抗肝纤维化机制的实验研究［J］.解放军医学杂志，2004，29（7）：560－562.