HPLC法测定新疆准噶尔乌头中双酯型生物碱

赵翡翠， 何 强， 李 杰

(1.新疆医科大学附属中医医院药学部，新疆乌鲁木齐 830000;2.新疆医科大学中医学院，新疆乌鲁木齐 830054)

准噶尔乌头为毛茛科植物准噶尔乌头Aconitum soongaricumStapf的干燥块根，主要产于我国新疆北疆地区，民间常做草乌的代用品使用，味辛、苦，大热，有毒，具祛风散寒、止痛消肿、通经活络的功效［1］。新疆地域辽阔，干旱高寒，生态环境恶劣，使风湿类疾病成为新疆地区常见病、多发病，且缠绵难愈，准噶尔乌头在治疗此类疾病方面，有其独特的优势［2］。同时，准噶尔乌头也是近年来生长于新疆草场的主要毒害草之一，已对新疆畜牧业造成较大的危害。因此，有必要尽快对准噶尔乌头的药用价值进行研究。据文献报道［3-4］，准噶尔乌头中含有准噶尔乌头碱、12-表-欧乌碱及12-表-脱氢欧乌碱，而准噶尔乌头是否含有大多数乌头属植物中所含的活性成分——双酯型生物碱 (乌头碱、次乌头碱、新乌头碱)尚未见报道，这将使进一步研究准噶尔乌头炮制减毒、药理作用受到很大程度的限制。因此，本实验采用HPLC方法测定准噶尔乌头中的活性成分，为新疆准噶尔乌头药用植物资源的进一步开发和利用奠定基础。

1 仪器与试药

Waters2695高效液相色谱仪 (美国Waters公司);AG—135电子分析天平 (梅特勒-托利多仪器有限公司);SK3300LH超声清洗器 (上海科导超声仪器有限公司);Direct—QTM5超纯水仪(Millipore公司)。乌头碱 (批号110720-200410)、新乌头碱 (批号110799-200404)和次乌头碱 (批号110798-200404)均购于中国药品生物制品检定所，其他试剂均为分析纯。

川乌样品分别购自安徽省亳州市双华中药饮片厂 (批号101001，产地:四川)、安徽省亳州市凯利中药饮片有限公司 (批号091210，产地:四川)、新疆奇康哈博维药有限公司 (批号20110501，产地:四川)，以上样品经新疆医科大学附属中医医院中药药学实验室李永和主任中药师鉴定均为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeliDebx.的干燥母根。

准噶尔乌头样品于2010至2011年分别采自新疆伊犁地区尼勒克、新源、特克斯等不同产地，共6批。以上样品经李永和主任中药师鉴定均为毛茛科植物准噶尔乌头Aconitum soongaricumStapf.的干燥块根。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验 采用X Bridge C18色谱柱 (250 mm ×4.6 mm，5 μm)，以甲醇-水-三氯甲烷 (浓氨水调节pH为10.62)(70∶30∶2)为流动相，体积流量为1.0 mL/min，进样量10 μL，检测波长为235 nm。理论板数按乌头碱峰计算应不低于2 000。结果供试品及对照品色谱分离度良好，见图1。

2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取乌头碱、新乌头碱、次乌头碱对照品适量，置10 mL量瓶中，加二氯甲烷溶解并定容至刻度，摇匀，得乌头碱质量浓度为0.201 2 mg/mL，新乌头碱质量浓度为0.043 2 mg/mL，次乌头碱质量浓度为0.041 9 mg/mL的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取本品粉末 (粉碎后过三号筛)约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加10%氨试液4 mL，湿润，精密加入乙醚20 mL，超声处理 (功率300 W，频率40 kHz;水温在25℃以下)10 min，放冷，再称定质量，用乙醚补足减失的质量，放置过夜，滤过，并用10 mL乙醚分3次洗涤药渣，合并滤液，置50℃水浴挥干，残渣用二氯甲烷溶解并转移至5 mL量瓶中，加二氯甲烷至刻度，摇匀，取续滤液，即得。

2.4 线性关系的考察 分别精密吸取2.2项下对照品溶液各 0.5、5、10、20、30、40、50、60、70 μL，分别测定峰面积积分值。以乌头碱对照品的进样质量浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，进行线性回归，得乌头碱回归方程y=363 962x+210 563，相关系数r=0.999 9。再分别精密吸取2.2项下对照品溶液各1、2、4、6、8、10、12 μL，分别测定峰面积积分值。分别以新乌头碱、次乌头碱对照品的进样质量浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，进行线性回归，得新乌头碱回归方程y=899 741x+305 2.5，相关系数r=0.999 9;得次乌头碱回归方程y=1 478 609.13x-30 112.29，相关系数r=0.999 9。表明，乌头碱进样质量浓度在0.100 6～14.084 0 mg/mL、新乌头碱进样质量浓度在0.043 2～0.518 4 mg/mL、次乌头碱进样质量浓度在0.041 9～0.502 8 mg/mL与峰面积呈良好的线性关系。

图1 HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms

2.5 精密度试验 精密吸取2.2项下对照品溶液10 μL，连续进样5次，按上述色谱条件进行测定，结果乌头碱、新乌头碱、次乌头碱峰面积的RSD分别为 0.71%、0.97%、1.02%，表明精密度较好。

2.6 稳定性试验 按2.3项下方法制备供试品溶液 (2010年，尼勒克县)，精密吸取，按上述色谱条件进行测定，每隔2 h进样一次，共考察8 h，结果乌头碱、新乌头碱、次乌头碱峰面积的RSD分别为0.75%、0.82%、1.45%，表明供试品溶液稳定性较好。

2.7 重复性试验 精密称取本品6份 (2010年，尼勒克县)，按2.3项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，结果乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的平均质量分数分别为8.531 1 mg/g，0.136 8 mg/g和 0.128 3 mg/g，RSD分别为1.25%，1.75%和1.70%。表明重复性较好。

2.8 加样回收率试验 取已知量准噶尔乌头样品(2010年，尼勒克县)6份，每份约0.5 g，精密称定，每份分别加入2.2项下对照品溶液各1 mL，按2.3项下方法制得供试品溶液。按上述色谱条件测定，计算回收率，结果见表1～3。表明本测定方法的回收率较好。

表1 乌头碱加样回收率测定结果Tab.1 Recovery results of aconitine

表2 新乌头碱加样回收率测定结果Tab.2 Recovery results of hypaconitine

表3 次乌头碱加样回收率测定结果Tab.3 Recovery results of mesaconitine

3 样品的测定

分别取不同产地和批次的准噶尔乌头和川乌样品，按2.3项下方法制得供试品溶液，进样10 μL，按上述色谱条件测定，测定结果见表4。

表4 测定结果 (n=3)Tab.4 Determination of contents(n=3)

4 讨论

4.1 由于准噶尔乌头与川乌为同属植物［6］，所以本实验测定准噶尔乌头中双酯型生物碱时先参照《中国药典》2010年版一部川乌项下的HPLC方法进行［5］，结果图谱分离效果不理想，对照品图谱分离效果也较差。因此，参考文献 ［7-10］对供试品前处理方法 (包括药材粉碎粒度、药材取样量、提取溶剂、提取方法)和流动相 ［分别采用甲醇-水-乙腈 (67 ∶33 ∶2)、甲醇-水-三氯甲烷-氨水(70∶30∶2∶0.1)、甲醇-0.3%三乙胺-三氯甲烷(69∶30∶1)、乙腈-0.04 mol/L三乙胺 (pH3)(35∶65)、乙腈-四氢呋喃 (25∶15)A-0.1 mol/L乙酸铵溶液 (每1 000 mL加冰醋酸0.5 mL)B等不同流动相］进行了考察，又对初步确定的流动相的比例进行了调整，最终确定了峰形较好、分离度较好的色谱条件和供试品前处理方法。

4.2 目前关于准噶尔乌头的研究报道很少，本实验采用HPLC法可同时测定准噶尔乌头中3种双酯型生物碱 (乌头碱、新乌头碱和次乌头碱)，经方法学验证表明该法简便、可行。

4.3 根据6批不同产地、不同采集时期的准噶尔乌头样品测定结果表明，本品与已有法定药材标准的川乌同样含有双酯型生物碱 (乌头碱、新乌头碱和次乌头碱)，其中乌头碱的质量分数高于川乌药材约24倍 (取不同产地的平均值)，新乌头碱的质量分数约为川乌药材的1/2，次乌头碱质量分数约为川乌药材的1/3，表明新疆准噶尔乌头中乌头碱质量分数较高，应具有抗炎镇痛、对免疫系统影响等药用价值［11-12］，但其与川乌所含的双酯型生物碱各成分质量分数相差较大，其确切的药理作用和毒性，以及与川乌药材的亲缘性仍有待进一步深入研究。

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