卡介苗提取物体外诱导小鼠脾淋巴细胞对人膀胱癌细胞的杀伤作用

蒋翡翎，单保恩，姚 敏，魏小斌，伍 燕，邓碧兰

(1.海口市人民医院检验科，海南 海口 5702082.河北医科大学第四医院科研中心，河北 石家庄 050011)

我们前面已有实验证明活卡介苗(BCG)的有效组分BCGE2和BCGE3在体外可以诱导小鼠脾淋巴细胞增殖及产生细胞因子[1]，并且BCGE2和BCGE3还可以诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生NO[2]，因此BCGE2和BCGE3可以作为免疫调节剂来诱导小鼠脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞。那么这些经诱导激活的小鼠脾淋巴细胞对肿瘤细胞是否具有杀伤或抑制作用呢？本研究旨在将人膀胱癌细胞株T24作为靶细胞对BCGE2的体外抗肿瘤活性进行了初步研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6～8周龄的昆明小鼠、体重18～22 g，购于河北医科大学实验动物中心。

1.2 主要试剂 BCG购于北京生物制品研究所，胎牛血清为杭州四季青生物工程材料公司生产，Sephadex G100凝胶层析柱购自Sigma公司，RPMI1640为GIBCO公司产品，Gress试剂购自华美生物公司，肿瘤细胞株T24由河北医科大学附属第四医院科研中心提供。

1.3 BCG蛋白提取液的制备及蛋白含量测定 用酶裂解法和超声波破碎法对活BCG进行裂解，用紫外吸收法测定其上清液中蛋白质(BCGE)的纯度；用考马斯亮蓝G250法测定蛋白含量。

1.4 BCGE蛋白活性组分的分离 将BCGE上样于Sephadex G100凝胶层析柱，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗脱，每管收集2 ml层析液，分离后得到3个组分，分别命名为 BCGE1、BCGE2和 BCGE3，其相对分子质量分别为42500 D、36300 D和28600 D。

1.5 肿瘤细胞株悬液制备 肿瘤细胞株T24细胞培养在RPMI1640完全培养液中，置于37℃，饱和湿度，5%CO2的培养箱中培养，待细胞进入对数生长期后收集细胞，用RPMI1640完全培养基调整成浓度为1×105个/ml的细胞悬液备用。

1.6 脾效应细胞悬液制备 无菌取小鼠脾脏，在200目钢筛上研磨，制备成单个细胞悬液，离心，弃上清，裂解红细胞后用Hank's液洗两次，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，调整细胞浓度为3.5×106个/ml。然后接种于24孔板，加入RPMI1640配制的BCGE2并调节使其终浓度为600μg/ml，作用48 h后收集细胞(对照组加RPMI1640培养液)，用台酚兰染色计算存活率为90%，后用D-Hank's液洗涤后调整细胞浓度为1×106个/ml。

1.7 淋巴细胞杀伤功能测定 参照改良四甲基偶氮唑盐比色法MTT法[3]，实验孔加待测的经BCGE2作用后的小鼠脾效应细胞悬液与T24细胞悬液各100 μl，调节效靶比为5:1、10:1、20:1(阴性对照组加入未经BCGE2作用的小鼠脾淋巴细胞悬液与T24细胞悬液，各100 μl，并调节效靶比为5:1、10:1、20:1)，另设单纯淋巴细胞(效应细胞)及T24细胞(靶细胞)对照，均设6个复孔。常规培养24 h后，加入MTT 100μl继续培养4 h，离心弃上清，每孔加入15%十二烷基磺酸钠(SDS)100μl，过夜。次日用酶标仪检测各孔吸光度(OD)值，测定波长为570 nm，参考波长为630 nm。计算淋巴细胞的杀伤活性。其计算公式为：淋巴细胞活性(%)=[靶细胞对照组OD值-(实验组OD值-效应细胞OD值)]/靶细胞对照组OD值×100%。

2 结果

镜下可见，对照组的膀胱癌细胞布满整个视野，加入效靶比为20:1的实验组，膀胱癌细胞显著减少，见图1。BCGE2体外可诱导和促进小鼠脾淋巴细胞对T24的杀伤作用。由表1结果可见，未经BCGE2诱导的小鼠脾淋巴细胞对膀胱癌细胞株仅具有较轻微的杀伤作用，在效靶比为20:1时其抑制率才达到13.32%。而经BCGE2诱导后的小鼠脾淋巴细胞对膀胱癌细胞株T24的杀伤作用显著增强(P＜0.01)，在效靶比为10:1时其抑制率为31.49%，当效靶比为20:1时其抑制率可高达42.31%。

图1 膀胱癌T 24细胞的镜下形态(×200)

表1 BCGE2体外诱导的小鼠脾淋巴细胞对膀胱癌T 24细胞的杀伤作用

3 讨 论

卡介苗是一种免疫调节剂，它可通过调节外周血CD4+/CD8+比例及自然杀伤细胞(NK细胞)活性来发挥其免疫调节作用，进一步维持和提高机体的免疫功能[4]。而NK细胞主要发挥非特异性杀伤活性，无需抗原预先致敏即能自发杀伤靶细胞且不受主要组织相容性复合体(MHC)限制，因此NK细胞是机体抗肿瘤的第一道防线。NK细胞释放的杀伤介质穿孔素、NK细胞毒因子等可使靶细胞溶解破裂。NK细胞还可通过抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)效应，杀伤被特异性抗体包被的瘤细胞，其机理为通过IgG1和IgG2抗体作桥梁，其Fab端特异性识别肿瘤，Fc段与NK细胞FcRgⅢa结合，产生抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用。NK细胞也可以将颗粒酶经穿孔素在靶细胞上形成的“孔洞”注入靶细胞从而使靶细胞DNA断裂而导致细胞凋亡[5]，因此NK细胞在抗肿瘤免疫中起重要作用。而肿瘤患者中的NK细胞的百分率往往是降低的，预示机体NK细胞作用受抑制,不能有效发挥杀伤肿瘤细胞的作用[6]。有研究表明BCG可以直接通过TLRs激活NK细胞[7]，使其直接对肿瘤细胞进行杀伤。NK细胞通过识别肿瘤抗原与靶细胞结合，结合后微管插入细胞膜，释放NK细胞溶瘤因子(NKCF)，NK细胞还可通过多次接触多个肿瘤细胞放大杀伤效应[8-9]。本研究结果也证实，经BCGE2体外诱导的小鼠脾淋巴细胞对肿瘤细胞株T24的杀伤活性显著增强(由于未预先采用抗原致敏，其活性细胞大多数为NK细胞)。未经BCGE2诱导的小鼠脾淋巴细胞对膀胱癌细胞株仅具有较轻微的杀伤作用，在效靶比为20:1时其抑制率才达到13.32%。而经BCGE2诱导后的小鼠脾淋巴细胞对膀胱癌细胞株T24的杀伤作用显著增强(P＜0.01)，并随着效靶比的增加而更为显著，提示BCGE2具有间接的抗肿瘤作用。

[1]蒋翡翎,单保恩,张淑芳,等.卡介苗提取物对小鼠脾淋巴细胞免疫调节作用的体外实验研究[J].中华肿瘤防治杂志,2007,14(11):827-829.

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