荧光定量RT-PCR检测宫颈癌患者外周血MMP-9 mRNA表达的临床意义

董小跃，张盛燕

（瑞安市妇幼保健院妇产科，浙江 瑞安 325200）

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一。虽宫颈癌的诊断及治疗方面取得一定的进展，但仍有20%～34%的早期宫颈癌患者最终死于肿瘤的复发和转移。血循环中微转移的存在，提示肿瘤已不再局限于原发灶，有发展为远处转移的可能。早期诊断外周血中的微转移，有助于我们更有针对性地进行个体化的术后辅助治疗，减少复发和转移，提高患者的生存率和生活质量。本研究利用RT-PCR技术检测早期宫颈癌外周血中上皮源性特异性标志基因MMP-9 mRNA的表达，探讨它们在宫颈癌外周血中的表达及临床意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择2005年1月至2010年6月间我院首诊的98例宫颈癌患者为研究对象。年龄22～78岁，平均48岁。临床分期[按照2000年国际妇产科联盟(FIGO)的标准]：ⅠA期8例，ⅠB期48例，ⅡA期7例，ⅡB 22例，Ⅲ期10例，Ⅳ期3例。按病理类型：鳞癌85例，非鳞癌13例；所有早期宫颈癌患者均予子宫次广切或子宫广切及盆清术，术后标本均行病理检查。对照组为同期手术的妇科良性肿瘤25例，其中子宫肌瘤18例，卵巢囊肿3例，子宫肌腺症1例，子宫内膜异位症3例。

1.2 主要试剂和仪器 Trial试剂(GIBLO公司)；逆转录酶M2MLV(Promega公司)；Taq酶(Sangon公司)；Light Cycler荧光PCR仪(德国Roche公司)。

1.3 方法 患者初诊治疗前抽取静脉血5 ml(弃去开始的1 ml，以防上皮细胞污染)，于20 min内用淋巴细胞分离液分离单个核细胞。用Trizol试剂(上海复星公司)进行总RNA的提取。测A260～280处的吸光值，并计算RNA含量。然而进行逆转录反应合成cDNA后再行PCR扩增。PCR反应条件：93℃ 2 min，93℃ 45 s，55℃ 60 s，共做40个循环。结果分析参考试剂盒。

2 结果

2.1 宫颈癌及妇科良性肿瘤的MMP-9 mRNA转录 宫颈癌组外周血MMP-9 mRNA有75例阳性，表达率为76.5%(75/98)，而对照组有12例阳性，表达率为48.0%(12/25)，两组比较差异均有显著统计学意义(P＜0.01)。在宫颈癌组内，早期（ⅠA+ⅠB+ⅡA）宫颈癌外周血MMP-9 mRNA有40例阳性，表达率为63.5%(40/63)，而中晚期（ⅡB+Ⅲ+Ⅳ）宫颈癌有31例阳性，表达率为88.6%(31/35)，两组比较差异存在统计学意义(P＜0.05)。

2.2 MMP-9 mRNA的表达与早期宫颈癌的单因素分析 ①年龄：年龄＜40岁的早期宫颈癌MMP-9 mRNA表达阳性与阴性比例分别为16例(40.0%)vs 4例(17.4%)，差异有统计学意义(P＜0.05)。②肿瘤分期：早期宫颈癌ⅠA、ⅠB、ⅡA MMP-9 mRNA表达阳性与阴性比例分别为6例(15.0%)vs2例(8.7%)，30例(75%)vs 18例(78.3%)，4例(10.0%)vs 3例(13.0%)，差异无统计学意义(P＞0.05)。③病理类型：早期宫颈癌病理类型中非鳞癌MMP-9 mRNA表达阳性与阴性比例分别为10例(25%)vs 2例(8.7%)，差异有统计学意义(P＜0.05)。④病理分化：表达MMP-9 mRNA的早期宫颈癌与未表达MMP-9 mRNA的早期宫颈癌低分化分别有14例(35%)和4 例(17.4%)，差异有统计学意义(P＜0.05)。⑤淋巴结转移：早期宫颈癌淋巴结转移者MMP-9 mRNA表达阳性与阴性比例分别为6例(15%)vs 2例(8.7%)，差异无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

表1 MMP-9 mRNA的表达与早期宫颈癌临床病理因素分析

3 讨 论

宫颈癌的复发转移是导致治疗失败及造成患者死亡的主要原因[1]，因此，如何更早发现亚临床期病变、评估治疗效果、监控复发是当前需要解决的关键问题。而肿瘤的微转移[2]是肿瘤复发转移的基础和前提.因此早期诊断肿瘤的微转移对指导个体化治疗和判断预后具有重要临床价值。RT-PCR技术的灵敏性较高，可检出1×107个正常细胞中的1个肿瘤细胞，使外周血微转移检测成为可能。实时荧光定量聚合酶链式扩增反应（PCR）作为一项新技术，可检测出106～108个单个核细胞中的一个肿瘤细胞，其巧妙地把核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起，借助荧光信号检测PCR产物。与普通PCR或巢式PCR相比，实时荧光定量PCR具有更可靠的灵敏度和特异性，其自动化的检测能最大限度减少污染，显著减少假阳性的发生率[3]。

基质金属蛋白酶是一个大家族，因其需要Ca2+、Zn2+等金属离子作为辅助因子而得名。基质金属蛋白酶（MMPs）几乎能降解细胞外基质（ECM）中的各种蛋白成分，破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，在肿瘤侵袭转移中起关键性作用，从而在肿瘤浸润转移中的作用日益受到重视，被认为是该过程中主要的蛋白水解酶。MMP-9是基质金属蛋白酶(MMPs)家族中的一员，为Ⅳ型胶原酶，可有效降解基底膜的主要成分Ⅳ型胶原及明胶，它的异常表达与人类许多恶性肿瘤的转移密切相关。在肿瘤组织中发现细胞角蛋白的存在，则意味着微转移的发生[4]。

本研究采用RT-PCR技术检测宫颈癌外周血中MMP-9 mRNA的转录。结果发现，MMP-9 mRNA在宫颈癌和对照组中的阳性率分别为76.5%和48.0%，两者差异有显著统计学意义(P＜0.01)。在宫颈癌中，中晚期宫颈癌外周血MMP-9 mRNA阳性率明显高于早期宫颈癌(88.6%vs 63.5%)，两组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。以上资料表明在宫颈癌外周血中存在表达MMP-9 mRNA的肿瘤细胞；同时MMP-9 mRNA的转录均显示了很高的特异性，通过RT-PCR技术检测宫颈癌外周血中肿瘤细胞具有较好的敏感性和特异性。

目前，尽管早期宫颈癌的5年生存率达85%～90%，但临床医师发现一部分无高危因素的，术后很快发生盆腔复发和转移的患者，预后较差。有关预后因素的探讨被引为宫颈癌临床处理依据或参考的有：肿瘤体积大小、宫颈间质浸润深度、宫颈癌生长形态及癌细胞类型、淋巴血管受侵、淋巴结转移、肿瘤组织非鳞癌成分；以及手术标本切缘与年龄、贫血[5]。文献报道，MMP-9 mRNA的转录与胃肠道、肺、乳腺等恶性肿瘤的预后因素如分期、浸润深度、淋巴结转移有关[6]。在本研究中，表达MMP-9 mRNA的早期宫颈癌与未表达MMP-9 mRNA的早期宫颈癌相比，年轻、低分化及鳞癌更多见，差异有统计学意义。上述资料提示微转移可能与上述因素有关，而其作用机制有待进一步探索和证实。对于MMP-9 mRNA患者给予加强预后监测或预防性治疗，可减少远处转移，改善预后，提高生存率。

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