miR-21、miR-155在乳腺癌患者血液与肿瘤组织中表达水平的相关性研究

卞国奉，陈爱军

(1.三峡大学第一临床学院，湖北宜昌443003；2.宜昌市中心人民医院普外三科，湖北宜昌443003)

miR-21、miR-155在乳腺癌患者血液与肿瘤组织中表达水平的相关性研究

卞国奉1，陈爱军2*

(1.三峡大学第一临床学院，湖北宜昌443003；2.宜昌市中心人民医院普外三科，湖北宜昌443003)

目的对健康女性血清及乳腺癌患者血清中miR-21和miR-155表达水平进行实时定量PCR检测，同肿瘤患者癌组织与对应癌旁组织的miR-21和miR-155表达水平的变化趋势相比较，以评价血清中miR-21和miR-155在乳腺癌早期诊断中的潜在价值。方法收集健康女性血液和患者血液与患者癌组织和癌旁组织，利用实时荧光定量PCR对提取的RNAmiR-21和miR-155进行相对定量检测，得到miR-21和miR-155在血清中变化趋势与在组织中变化趋势的相关性。结果miR-21和miR-155在肿瘤组织的表达水平明显高于其在癌旁组织的表达水平，miR-21和miR-155在乳腺癌患者血清中的表达水平也要高于其在健康体检者血清中的表达水平。血清中miR-21和miR-155表达水平变化趋势与组织中miR-21和miR-155表达水平变化趋势一致。结论血清中miR-21和miR-155能反映乳腺癌的发生，miR-21和miR-155有可能作为乳腺癌早期诊断的肿瘤标志物。

MicroRNA；乳腺癌；肿瘤标记物；miR-21；miR-155

MicroRNA(又叫miRNA或微RNA)是一类内源性非编码的小RNA，广泛存在于动物、植物和病毒中，通过与目标mRNA的3'UTR序列互补配对，调控靶基因的表达或翻译，参与生物体的发育、炎症、肿瘤等多种生理、病理过程[1-3]。最近发现MicroRNA常常在癌症中异常表达，一些MicroRNA在癌症中上调，而另一些则下调。MicroRNA在乳腺癌中表达谱的研究提示了可能作为一种新的疾病诊断，分类和预后判断的工具，越来越多的证据表明MicroRNA的分析可以用于恶性肿瘤的诊断、预后判断和治疗[4-6]。

俄亥俄大学Croce的实验室已经发现了5种MicroRNA是成功鉴别正常组织与肿瘤组织所必需的，本实验以癌组织比癌旁组织表达量升高的miR-21、miR-155为代表[3]，以U6作为参照物分析患者血清、健康女性血清中miRNA的变化趋势和癌组织、癌旁组织miRNA变化趋势的相关性，得到血清miRNA作为肿瘤标志物早期诊断乳腺癌的可能性。

1 资料与方法

1.1 实验材料41例乳腺癌患者肿瘤组织及相应癌旁组织(距肿瘤边缘≤3 cm)、术前外周血各一份。并收集健康女性体检者外周血41份，保存至超低温冰箱中。所有患者取血之前均未进行手术、化疗、放疗或内分泌治疗。不限制患者的年龄、肿瘤分级和分期，但既往有肿瘤病史和其他部位转移的乳腺肿瘤排除在外。正常对照者为同一时期进行年度体检的正常人群，入选标准是无肿瘤病史和临床体征的女性健康体检者。所有标本均来自宜昌市中心人民医院。

1.2 实验试剂TRIzol购于Invitrogen公司；cDNA第一链合成试剂盒购于Fermentas；RNA提取试剂盒购于天根生化科技有限公司(DP433)；SYBR荧光定量PCR检测试剂盒购于Fermentas；引物合成由南京金斯瑞生物科技有线公司完成；实时荧光定量PCR仪Illumine eco；离心机购于Eppendorf。

1.3 相关引物miR-21：loop primer5'-GTCGT ATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGA TACGACTCAAC-3'，上游引物：5'-TGCGCTAGCTTA TCAGACTGAT-3'，下游引物：5'-CCAGTGCAGGGT CCGAGGTATT-3'；miR-155：loop primer5'-GTCGTA TCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGAT ACGACGGGGT-3'，上游引物：5'-TGCGCTAATGCT AATCGTGATA-3'，下游引物：5'-CCAGTGCAGGGTC CGAGGTATT-3'；U6上游引物：5'-CGCTTCGGCAG ACATATAC-3'，下游引物：5'-AAATATGGAACGCTT CACGA-3'。

1.4 实验步骤

1.4.1 TRIzol法提取RNA严格按试剂说明书操作。所有标本经紫外分光光度检测OD260/OD280比值为1.8～2.0方可进行后续操作。

1.4.2 逆转录按如下成分配置反应体系：TotalRNA、miRNA-loop primer(内参基因加Oligo dT)、dNTP，并用水补不足。70℃5 min，短暂离心后置于冰上急冷。然后在管中加入5×RT buffer、HRP(RRI)/ RNase Inhibitor、M-MLV、ddH2O(Rnase free)，置于仪器上42℃60 min，95℃5 min。

1.4.3 PCR扩增按如下成分配置反应体系：miRNA上游引物，下游引物，dDNTP，ExTaq，10×ExTaqE buffer，cDNA，ddH2O。反应条件94℃4 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃25s；72℃4 min，4℃4 min，35个循环。

1.4.4 实时荧光定量PCR按如下成分配置反应体系：cDNA，上游引物，下游引物，SYBR Green/ Flourescein qPCR Master Mix，ddH2O，反应条件：Cycle 1：(1×)50.0℃2 min，95.0℃10 min，Cycle 2：(40×)95.0℃30 s，60.0℃30 s。

1.5 统计学分析记录每个反应管中的荧光信号到达所设定的域值时所经历的循环数(Ct)，采用定量PCR中的相对定量法，用检测到的Ct值，以U6 ncRNA的量为内参照，以癌旁组织和健康女性血清为对照，计算miR-21//155的相对量，计算公式：F＝2－△△Ct，△△Ct＝(CtmiR-21/155-CtU6 ncRNA)肿瘤/血清-(CtmiR-21/155-CtU6 ncRNA)对照，F代表miR-21/155在肿瘤组织或血清的表达相对于配对癌旁组织或健康女性血清的差异表达倍数。配对设计资料用Wilcoxon符号秩检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 紫外分光光度计检测各标本总RNA吸光度比值总RNA提取之后，将其加入DEPC水中(稀释100倍)，测260 nm、280 nm吸收值，计算OD260/280比值和浓度(μg/ml)，本实验总RNA溶液OD260/280比值波动于1.8～2.0，说明提得的总RNA纯度较高，符合后续试验的要求。

2.2 miRNA扩增曲线miR-21、miR-155、U6 ncRNA的扩增曲线见图1，分为三个阶段：荧光背景信号阶段、指数扩增阶段、平台期。其形状是一条平滑的S型曲线。

2.3 miRNA溶解曲线miR-21、miR-155、U6 ncRNA扩增产物显示单一溶解峰，见图2，说明引物设计合理，无非特异性扩增，符合实验要求。

2.4 标本实时定量PCR结果经公式计算miR-21/155的相对表达量，患者血清中miR-21相对表达量为健康女性的2.387倍，血清中miR-155相对表达量则为2.274倍。患者肿瘤组织中miR-21相对表达量为癌旁组织的1.638倍，组织中miR-155相对表达量则为2.137倍。以上分析结果提示在乳腺癌患者血清miRNA的变化趋势与组织中的一致。采用配对样本的Wilcoxon符号秩检验，P＜0.05，差异有统计学意义。说明这两个指标的变化均能提示乳腺癌的发生，miR-21/155有成为乳腺癌肿瘤标记物的可能，可以用于乳腺癌的早期诊断。

图1 U6 ncRNA、Hsa-miR-155、Hsa-miR-21扩增曲线

图2 U6 ncRNA、Hsa-miR-155、Hsa-miR-21溶解曲线

3 讨论

近年来的研究结果表明，miR-21和miR-155在乳腺癌的发生发展中可能起到了关键作用，Iorio等[7]采用微阵列和Northern印迹方法发现，miR-155和miR-21在乳腺癌组织中高表达几倍到几十倍。但它们引起乳腺癌发生发展的具体机制鲜被报道。

实时荧光定量PCR(Realtime RT-PCR)是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术，于1996年由美国Applied biosystems公司推出。相对于普通的PCR，操作时受污染的机会少、自动化程度高、功能强大、省时、特异性和灵敏度也较高。成熟的MicroRNA长平均长度为22 nt，同类的MicroRNA甚至只有一两个碱基的差别，且提取出来的RNA易受外界污染，这些特点给传统的Northern blot、Microarray、RT-PCR等常规检测手段带来了极大的困难和挑战，其结果特异性也不强[8]。本实验采用Realtime RT-PCR检测组织与血液里miR-21和miR-155的表达，通过检测吸光度表达，溶解曲线单峰及对照结果，可以看出采用茎环RT逆转录引物的Realtime RT-PCR技术对乳腺癌相关MicroRNA的检测灵敏性较高，检测结果可信度高。肿瘤的发生发展及转移都伴随着miRNA表达谱的变化[9]。大多数情况下，肿瘤组织中的miRNA表达水平比正常组织低，也有部分miRNA在肿瘤组织中的表达水平升高。本实验选取的两个miRNA在肿瘤样品中都与血液样品中表达水平均上调，与肿瘤的发生有正向调节作用。因为MicroRNA在组织及血液中表达量甚微，实验选取的两个指标上调，相对于负向调节作用的MicroRNA，更容易被检测到，为miR-21和miR-155成为乳腺癌肿瘤标记物提供了帮助。

实时定量PCR实验设计和数据分析可以采用相对定量和绝对定量两种方法，如果需要知道绝对的拷贝数，就必须用绝对定量的方法，否则只需要给出基因表达相对量就足够了。相对定量可能比绝对定量要更容易一些，因为它不需要作标准曲线。本实验采用相对定量法，通过2－△△Ct法分析相对基因表达差异更简单方便。

本实验中乳腺癌患者肿瘤组织中miR-21和miR-155的相对表达量明显大于癌旁正常组织的表达，患者血清中的miR-21和miR-155的相对表达量亦明显大于健康女性血清中的表达，组织与血清中的miR-21和miR-155变化趋势相一致，提示miR-21和miR-155这两个指标有成为乳腺癌肿瘤标记物的可能，可用于乳腺癌的早期诊断。这种方法也可以推广到其他肿瘤中去，找出各个肿瘤中特异性较高的MicroRNA，在更多实验基础上证明MicroRNA是一种可靠的生物标记，且能被简单准确地检测出来。如此，将会在极大程度上促进肿瘤的早期诊断的发展，为患者赢得宝贵的时间。

[1]He H,Jazdzewski K,Li W,et al．The role of microRNA genesin papillary thyroid carcinoma[J].Proc Natl Acad Sci USA,2005,102 (52)：19075-19080.

[2]Chan JA,Krichevsky AM,Kosik KS.MicroRNA-21 is an antipoptotic factor in human glioblastoma cells[J].Cancer Res,2005,65 (14)：6029-6033.

[3]Szafranska AE,Davision TS,John J,et al.MicroRNAexpression alterations are linked to tumorigenesis and non-neuplastic processs in pancreatic ductal adenocarcino[J].Oncogene,2007,26(30)：4442-4452.

[4]Calin GA.Croce CM 2006 MicroRNA signatures in human cancers [J].Nature reviewa,6：857-866.

[5]Calin GA.Croce CM 2006 MicroRNA-cancer connection：the beginning of a new tale[J].Cancer research,66：7390-7394.

[6]Jeyaseelan K,Herath WB,Armugam A.MicroRNAs as therapeutic targets in human diseases[J].Expert opinion on therapeutic targets, 2007,11(8)：1119-1129.

[7]Iorio MV,Ferracin M,Liu CG,et al.MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer[J].Cancer research,2005,65：7065-7070.

[8]Hamm and SM.microRNAdetection comes of age[J].Nature Methods,2006,3(1)：12-13.

[9]Davis S,Lollo B,Freier S.Improved targeting of miRNA with antisense oligonucleotides[J].Nucleic Acids Res,2006,34(8)：2294-2304.

Correlation study of the expression of miR-21 and miR-155 in the blood and tumor tissue of patients with breast cancer.

BIAN Guo-feng1,CHEN Ai-jun2.1.The First Clinical College of China Three Gorges University, Yichang,443003,Hubei,CHINA;2.The Third Department of General Surgery,the Central Hospital of Yichang City, Yichang 443003,Hubei,CHINA

ObjectiveTo evaluate the expression levels of miR-21 and miR-155 in the serum of breast cancer patients and healthy women by real-time quantitative PCR,compared with the variation trend of the expression level of miR-21 and miR-155 in tumor tissue samples.MethodsThe samples were collected from the intraoperative tumor tissue,adjacent tissue,and the peripheral blood of patients and from the peripheral blood of healthy women.The miR-21 and miR-155 obtained were detected by real time quantitative PCR.Then the relationship between the trend of miR-21 and miR-155 in serum and in tumor tissues was analyzed.ResultsThe expression levels of miR-21and miR-155 in adjacent tissues of breast cancer patients were significantly lower than those in tumor tissues.The expression levels of miR-21 and miR-155 in the serum of breast cancer patients were significantly higher than those of healthy women.ConclusionThe levels ofserum miR-21 and miR-155 can be used asbiomarkers forthe early diagnosisofbreastcancer.

MicroRNA;Breast cancer;Tumor marker;miR-21;miR-155

R737.9

A

1003—6350（2012）18—001—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.18.001

2012-03-11)

卞国奉(1985—)，男，湖北省宜昌市人，住院医师，硕士。

*通讯作者：陈爱军(1964—)，男，湖北省宜昌市人，硕士生导师，教授，研究方向：普外肿瘤。E-mail:chenaijun@163.net