兔病毒性出血症病毒“LQ”株的分离鉴定

刘 勇，方鹏飞，欧阳宇艺

（四川省华派生物制药有限公司，四川 简阳 641400）

兔病毒性出血症俗称兔瘟，是由兔病毒性出血症病毒（RHDV）所致的一种兔急性、败血性、高度接触性、致死性和以全身实质器官出血为主要特征的传染病，尤以长毛兔最为易感，主要侵害2月龄以上的青壮年兔。本病于1984年初首先在我国江苏等地暴发，随即蔓延到全国多数地区。RHDV属杯状病毒科，病毒粒子呈球形，直径32～36 nm，为十二面体对称，无囊膜。RHDV与其他杯状病毒相比血凝特性显著，能凝集人类的各型红细胞。本试验对成都龙泉某兔场疑似出血症发病死亡的兔的病料进行病原分离鉴定，以确诊是否为兔病毒悸出血症感染。

1 材料与方法

1.1 试剂 改良马丁琼脂、麦康凯琼脂、厌气肉肝汤培养基，由青岛海博生物技术有限公司提供；甲醛，由成都市科龙化工试剂厂提供；人“O”型红细胞，由本公司“O”型血同事提供。

1.2 毒种 兔病毒性出血症病毒北京株，由中国兽医药品监察所提供。

1.3 RHDV抗血清 由本公司质量管理部自制。

1.4 试验兔 日本大耳白兔，体重2.0kg，由四川省实验动物专委会养殖场提供。

1.5 细菌学检查 对无菌采集的病料进行细菌学分离培养，接种含4%血清及0.1%裂解全血的改良马丁琼脂平皿、麦康凯琼脂平皿、厌气肉肝汤，37℃下培养5日，观察记录结果。

1.6 RHDV LQ株的血凝性试验 采用微量法。先将病料肝脏1份加9份生理盐水研磨，离心取上清备用；再取25μL上清在96孔板上作倍比稀释，每孔加入25μL 1%人“O”型红细胞悬液；并设立红细胞对照孔，以红细胞100%凝集的最高稀释度作为判定终点。

1.7 RHDV LQ株的特异性试验 采用微量法。先配制4个血凝单位（即4HA）血凝素，在96孔板上每孔加25μL 4HA血凝素，然后加RHDV抗血清25μL，37℃感作30min后，加入25μL 1%人“O”型红细胞悬液，室温静置15～30min观察结果。同时设立生理盐水对照、RHDV抗血清对照、4HA对照。当生理盐水对照组、RHDV抗血清对照组、4HA血凝素与RHDV抗血清中和组均不凝集，而4HA对照组呈100%的红细胞凝集时，判定RHDV LQ株为兔出血性病毒特异性阳性。

1.8 RHDV LQ株的毒力鉴定

1.8.1 RHDV LQ株致病性鉴定 用生理盐水将RHDV LQ株病料作10倍稀释，颈部皮下接种4只健康易感试验兔，每只1.0mL,观察96h并记录接种兔的发病时间、临床症状、病理剖解变化。采集死亡接种兔的肝脏病料，重复以上试验，连续4次，详细记录，并同时进行血凝效价测定、特异性试验。

1.8.2 RHDV LQ株对家兔半数致死量的测定 取第5代RHDV LQ株肝组织，用生理盐水作10倍系列稀释，取 10-5、10-6、10-7、10-84 个稀释度，每个稀释度分别颈部皮下注射6只健康易感兔，1mL/只，观察7d，并详细记录。

2 结果

2.1 细菌学检查试验 37℃培养5日后，发现含4%血清及0.1%裂解全血的改良马丁琼脂平皿、麦康凯琼脂平皿、厌气肉肝汤中均无细菌生长。

2.2 RHDV LQ株的血凝性试验 结果见表1。由表1可知:RHDV LQ 株可凝集人“O”型红细胞，HA为 10×26。

表1 RHDV LQ株的血凝性试验结果

2.3 RHDV LQ株的特异性试验结果 见表2。试验结果表明:RHDV LQ株的血凝特性可被RHDV标准阳性血清中和，证明RHDV LQ株具有特异性。

表2 RHDV LQ株的血凝性试验结果

2.4 RHDV LQ株的毒力鉴定试验结果 见表3、表4。试验结果表明:RHDV LQ株连续传代4次均对家兔具有高致病性，证明RHDV LQ株为强毒株。根据表4数据按Reed-Muench法计算RHDV LQ株对家兔的LD50为 10-6.87/mL。

表3 RHDV LQ株传代试验结果

表4 RHDV LQ株对家兔的LD50测定结果

3 结论

3.1 通过细菌学检查、血凝性试验、特异性试验，确定此次从龙泉某兔场所分离的病原为兔出血性病毒。对RHDV LQ株的鉴定结果表明:此毒株是具有血凝特性、高致病力的RHDV强毒株。

3.2 兔病毒性出血症是影响养兔业的重要疾病。本公司正在对RHDV LQ株进行更深入地研究和试验，力争研制出安全、高效、经济的疫苗应用于兔业生产中。

[1]殷震，刘振华.杯状病毒科[A].动物病毒学[M].2版.北京:科学出版社，1997:525-530.

[2]中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典2010版三部[M].北京:中国农业出版社，2011.