P17菌株产生磷酸酶的影响因素及其定域研究

钟传青，黄为一

(1.山东建筑大学市政与环境工程学院，山东 济南 250101;2.南京农业大学生命科学学院，江苏 南京 210095)

0 引言

凡促使磷酸中的酯和酐水解的一大类酶，统称为磷酸酶，磷酸酶是土壤中最活跃的酶类，其酶促反应能够加速有机磷的脱磷速度[1]。磷酸酶是表征土壤生物学活性的重要酶之一[2]，其活性可作为衡量土壤肥力的指标;产生酸性磷酸酶的生物有微生物、原生动物和植物等;产生碱性磷酸酶的生物有微生物、藻类、蚯蚓等[3]。编码磷酸酶的基因已经被克隆出来[4]，张国庆等分离纯化了一株内生真菌中的酸性磷酸酶[5]。

磷是促进植物生长的重要元素之一[6]，无论是酸性磷酸酶还是碱性磷酸酶，均与土壤有效磷有很强相关性[7]。P17菌株为作者从南京市化工磷肥厂区磷矿粉与土的混合物中分离出的一株解磷微生物，经鉴定属于巨大芽孢杆菌属，该菌株能够分泌高活性的磷酸酶[8]，将土壤中难溶性有机磷转化为有效磷，从而可以直接被植物生长利用。作为一种酶类，磷酸酶的活性受多种因素影响，为保证解磷微生物P17菌株施入土壤后发挥高的解磷活性，本课题组研究了P17菌株发酵过程中影响磷酸酶活性的因素，并确定该酶的定域，为巨大芽孢杆菌磷酸酶制剂的制备及下游生产提供理论依据。

1 实验材料与方法

1.1 仪器与材料

仪器:摇床，显微镜，分光光度计，离心机等。

菌株:P17菌株。

培养基:NBRIP培养基。其成分为:Ca3(PO4)25.0g，(NH4)2SO40.1g，MgSO4·7H2O 0.25g，KCl 0.2 g，葡萄糖10.0g，MgCl2·7H2O 5.0g，蒸馏水 1000mL，pH6.8 ～7.0。

1.2 试剂

磷酸酶活性测定:改进的MUB缓冲液;0.025M对硝基苯磷酸二钠溶液;0.5M氯化钙;0.5M氢氧化钠;标准对硝基酚溶液。

磷酸酶定域研究:10mmol/L Tris·Cl(pH8.0);10mmol/L Tris·Cl(pH7.5);25%蔗糖。

发酵液蛋白含量测定所需试剂:0.15mol/L NaCl溶液;标准溶液;考马斯亮蓝试剂。

1.3 方法

(1)不同碳、氮源对P17菌株产生磷酸酶活性的影响

分别用等量碳源，如蔗糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖、糊精、木糖、山梨糖、淀粉等替代NBRIP培养基内的葡萄糖;或者用等量氮源如氯化铵、磷酸氢二铵、硝酸铵、硝酸钠、黄豆粉、胰蛋白胨、蛋白胨、尿素、牛肉膏、酵母膏等替代NBRIP培养基中的硫酸铵，其它成分和含量保持不变。

表中：ρ为土体密度，ω为天然含水率，ωp为土体塑限，ωL为土体液限，c为粘聚力，φ为内摩擦角，k为土体的渗透系数。

配制含不同碳源、氮源的培养基，每种碳源、氮源各设三个重复，分装50mL于250mL三角瓶中，灭菌。按5%接种量接种在含不同碳源、氮源培养基内，48h后检测发酵液pH值、吸光值(550nm)、上清酸性和碱性磷酸酶活性。

(2)磷酸盐种类与P17菌株生长以及磷酸酶活性的关系

分别用等量磷酸盐替代NBRIP培养基中的磷酸钙，接种后检测磷酸盐种类对P17菌株的生长、发酵液pH值以及酸性、碱性磷酸酶活性的影响。

(3)磷酸酶活性测定

按照佩奇等提供方法检测发酵液中磷酸酶活性[9]。

(4)发酵液pH值测定

(5)发酵液生物量测定

打开分光光度计，将波长调在550nm，预热半小时后测量发酵液的吸光值。

(6)磷酸酶定域研究

取发酵24h菌液，按照戴树桂等方法测定酶域所在[10]。

2 结果与分析

2.1 不同碳源与P17菌株生长及其磷酸酶活性的关系

由表1可知，P17菌株在以葡萄糖为碳源时酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性最高，菌体生长量最大，利于代谢产物的产生;而以麦芽糖、糊精和可溶性淀粉等复合碳源为碳源时P17菌株产生的磷酸酶活性较低;以甘露醇和可溶性淀粉为碳源时产生的碱性磷酸酶活性较低。

表1 碳源种类对P17菌株生长以及产生磷酸酶活性的影响

2.2 不同氮源与P17菌株生长磷酸酶活性的关系

表2 氮源种类对P17菌株生长以及产生磷酸酶活性的影响

表2中数据表明，巨大芽胞杆菌P17菌株在以黄豆粉、胰蛋白胨复合氮源等为氮源时能够产生较高活性的酸性磷酸酶;以胰蛋白胨、蛋白胨、酵母膏等为氮源时也能产生很高活性的碱性磷酸酶。可能是复合氮源内含有能够提高磷酸酶活性的微量元素或者金属离子。

2.3 磷酸盐种类与P17菌株生长以及磷酸酶活性的关系

由图1可以看出，发酵过程中，以各种磷酸盐为磷源时巨大芽孢杆菌P17菌株产生的酸性磷酸酶活性除以黄麦岭磷矿粉为磷源外普遍高于碱性磷酸酶活性。以植酸钙为磷源时酸性磷酸酶活性最高，说明有机磷源较少时会诱导酸性磷酸酶的产生;而培养基中没有有机磷源、只有难溶无机磷源时酸性磷酸酶仍有活性，说明培养基中存在其它底物如微生物菌体细胞膜的磷脂、核酸等，也可能与菌体生长量有关，以植酸钙为磷源时巨大芽孢杆菌P17菌株长势最好，从而促进了酸性磷酸酶的分泌。而碱性磷酸酶在培养基中没有磷源时活性最高，其次为黄麦岭磷矿粉，以NH4H2PO4为磷源时该方法不能检测碱性磷酸酶活性。

图1 巨大芽孢杆菌P17菌株以不同含磷物质为磷源时磷酸酶活性比较

2.4 磷酸酶定域研究

表3 P17菌株产生磷酸酶定域的研究结果

由表3可以看出，巨大芽孢杆菌P17菌株发酵至16h甚至48h后，各成分酶活性大小顺序为:磷酸酶胞外提取液S1+S2+S3＞膜内提取液S5＞膜周质提取液S4。说明酸性磷酸酶和碱性磷酸酶均为胞外酶，在发酵过程中大部分被分泌到胞外。

3 研究结论

前期研究表明P17菌株能够有效溶解植酸钙、卵磷脂等[8]，并且能够分泌大量的有机酸和无机酸[11]，将土壤、磷矿粉中的难溶性磷转变为有效磷，以利于植物吸收。本研究结果表明P17菌株能够产生高活性的磷酸酶，且不同的碳源、氮源及磷酸盐对于该菌株磷酸酶的活性有着较大的影响，相同的碳源、氮源及磷酸盐对该菌株酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的影响结果不同。该菌株以葡萄糖为碳源、黄豆粉等复合氮源、植酸钙为磷源时酸性磷酸酶活性最高，且该菌株分泌的酸性和碱性磷酸酶均为胞外酶。磷酸酶可以直接将难溶的有机磷转化为植物可以直接吸收利用的无机磷，该菌株能够分泌磷酸酶解释了巨大芽孢杆菌的作用机制。从研究结果来看，因磷酸酶为胞外酶，表明其发酵液可以直接用于农业生产;同时该研究也为深入探讨解磷微生物促进植物生长的作用机制、生物磷肥和磷酸酶制剂的研究与开发奠定了理论基础。

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