改良二血管阻断加低血压法制作大鼠全脑缺血再灌注模型

武钊 黄伟青 文锐玲 黄瑞娇 郭兰英 洪妙玲 刘佩仪

改良二血管阻断加低血压法制作大鼠全脑缺血再灌注模型

武钊 黄伟青 文锐玲 黄瑞娇 郭兰英 洪妙玲 刘佩仪

目的探讨二血管阻断加低血压法建立大鼠全脑缺血再灌注模型制作方法的改良，以增加铸模的成功率。方法21只SD大鼠随机分为实验组16只，对照组5只。实验组采用改良二血管加低血压法制模，对照组不做任何处理;对实验结果进行统计，计算出存活例数和死亡例数之后开颅取大脑组织进行形态学检查，再根据检查结果统计出造模成功率。结果16只大鼠中均无死亡现象，2只缺血效果不佳，造模成功率87.5%。经HE染色后可观察到实验组与对照组相比脑组织出现大量神经元坏死，胞浆浓缩，核固缩现象。结论改良的二血管阻断加低血压法可以有效的降低造模的死亡率，能够较好的建立大鼠全脑缺血再灌注模型，对脑复苏的进一步研究提供良好实验基础。

二血管阻断加低压法;全脑缺血再灌注模型;有创血压

目前针对心肺脑复苏的保护机制及其方法的研究越来越得到重视，通过全脑缺血再灌注模型模拟心跳骤停，而建立有效的、稳定的全脑缺血再灌注模型是实验研究的基础。目前国内广泛采用的是Pulsinelli四血管闭塞法制模［1］，但是其制模过程复杂、成模效果差及死亡率高。为提高制模的成功率本实验参照国外推荐的二血管阻断法加低血压法［2］建立缺血模型，并在原有基础上融入静脉留置针插管技术［3］进行改良，制模的成功率有了较大的提高，为进一步的深入研究提供良好实验基础。

1 材料与方法

1.1 分组与材料

1.1.1 实验动物与分组 健康的成年SPF级SD大鼠21只，雌雄不限，体质量230～280g，随机分为实验组16只与对照组5只。

1.1.2 材料 BL-420生物机能试验系统由四川泰盟科技有限公司生产、一次性静脉留置针(规格24G×3/4，0.7×19mm)由贝朗医疗上海国际贸易有限公司生产、微型钢丝止血夹由广州祥鸿医疗设备有限公司提供;三通管、连接器等。

1.2 实验方法

1.2.12 %戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉，取仰卧位固定。用手术刀切开右侧股动脉处皮肤，在切口处可看见神经与股动、静脉伴行，白色为神经、鲜红色为股动脉、暗红色为股静脉。准确分离股动脉后以丝线结扎远心端，再穿2根线备用。待股动脉充盈10～15min。滴加生理盐水以保持组织湿润。

1.2.2 颈正中切口，分离双侧颈总动脉后穿线备用。

1.2.3 待股动脉充盈后，用微型动脉夹夹闭股动脉近心端，采用静脉留置针行动脉插管，后以丝线固定，将留置针和已充满肝素的三通管、连接管与BL-420F生物机能记录系统连接。撤下动脉夹，通过三通管注射肝素150IU/kg达到全身肝素化。

1.2.4 保证股动脉到压力传感器的接头相通连，通过生物机能记录系统监测动脉血压。通过三通管回抽血液至平均动脉压达30～40mm Hg，然后用微型动脉夹夹闭双侧颈总动脉，进入缺血期，并观察眼球颜色变化及呼吸状况。

1.2.5 缺血15～25min后移去微型动脉夹去除双侧颈总动脉的夹闭，回输血液，此为再灌注期，本实验再灌注期时间为120min。

1.2.6 断头后开颅取大脑组织置于4%多聚甲醛液中固定。将大脑头顶前后按1∶3∶1的比例沿冠状面切为三分，取中间的3/5用来制作石蜡切片;用苏木素-伊红(HE)染色，光镜观察实验组与对照组顶叶皮层和海马区的形态学变化。

2 结果

2.1 实验组16只大鼠无一死亡，14只铸模成功，2例成模效果不佳，成功率为87.5%。

2.2 大脑组织外管病理变化 对照组大鼠脑组织无肿胀，脑沟脑回清晰，皮层颜色较红润;浅表血管丰富，充盈好，鲜红，实验组大鼠脑组织有明显肿胀，脑沟脑回表浅，皮层颜色苍白。表面血管塌陷，血流少。其中部分出现血液无复流的现象。如图1-2。

图1 对照组大鼠脑组织

图2 实验组大鼠脑组织

2.3 大脑组织显微镜下的病理变化 经HE染色后在光学显微镜下观察海马组织及神经元细胞。对照组大鼠神经元细胞排列规则、整齐，胞浆丰富，核呈圆形，核仁清楚;而实验组大鼠脑组织病理改变明显，可见大量神经元变性坏死，排列紊乱，神经元胞浆浓缩，胞核固缩，核仁不清。

图6 实验组大鼠神经元细胞(HE染色，400×)

图5 对照组大鼠神经元细胞(HE染色，400×)

3 讨论

由于心脏骤停而引起的脑组织缺血缺氧损伤严重的威胁人类健康，因此相关研究也引起了专家学者的重视。目前文献报道大多以脑的急性缺血再灌注为实验研究基础［4］，如何建立有效、可行的动物实验模型是进行后续实验的关键。

本实验选用由Smith等［5］提出的二血管阻断加低血压法制模，并在原有的基础上进行创新改进，融入静脉留置术与三通管，解决了传统方法的以下问题:1.由于需要监测血压，所以必须行动脉插管术，但由于大鼠血管细小、管壁薄等特点，传统方法使用头皮针时，在进针过程中针尖过于锋利，很容易出现血管穿破、断裂的现象;而本实验选用静脉留置针，由于其特殊的构造(针套、外套管、针芯和肝素帽四个组成部分)可有效的避免类似意外的发生。在进针后4～5mm处即可把内针芯拔掉，进行结扎固定。2.在成功建立动脉插管后，对颈静脉进行血液回抽以及颈动脉夹闭时，大鼠麻醉如果不是非常完全，很可能出现由于大鼠挣扎而导致插管与动脉结扎处的结扎线松动致动脉插管滑出或插破血管等意外;而采用静脉留置针，其插入血管内的部分为橡胶套，质地柔软、圆钝，不易松动或插穿血管。3.传统的方法是做颈静脉的插管抽放血液，这样增加一条血管的损伤无疑会加大对大鼠自身的伤害，在加上大鼠血管插管本身就具有相当的难度，如此就进一步增添了实验的复杂性;本实验则选择引入三通管，由三通管连接生物换能器、留置针、注射器，通过三通管实现血液的抽放、回输以及血压的监测。

近年来，出现了多种针对建立全脑缺血再灌注模型的实验方法，包括:四血管阻断法、颈动脉负压分流法、三血管阻断法、二血管阻断加低血压法、改良的Pulsinelli四血管闭塞法等，每种方法都具有各自的优势与不足，根据不同实验需要选择合适的方法尤为重要。本实验选用的二血管阻断加低压法具有手术过程简单、成模效率高、易于建立再灌注、更符合血液流变学的要求等特点，除此外各鼠出现脑梗死范围也较一致，故常用于模拟临床上休克、心功能不全、脑血管严重狭窄或阻塞合并血液低灌注引起的脑循环障碍造成不同程度的脑组织缺血损伤。对探讨缺血性脑损伤的发病机理，评价抗脑缺血药物的疗效有较高的价值［6］。

本研究实验组16只大鼠无一例死亡，仅2例制模效果不佳，造模成功率达87.5%。观察其结果可较好地模拟临床上因心脏骤停造成的全脑缺血损伤和循环抑制导致的大脑低灌注状态。

以上研究结果表明，改良的二血管阻断加低压法建立全脑缺血再灌注模型有较高的成功率，并且操作简单、重复性性好，可为脑缺血的深入研究提供良好实验基础。

［1］PulsinelliWA，JamesB，BrierlyM.A newmodelofbilateral ischemia ln the unanesthetized rat.Stroke，1979，10(3):267-272.

［2］周光新，高诚，徐平.人类疾病动物模型复制方法学.上海:上海科技文献技术出版社，2008:160.

［3］梁成结，朱志荣，谢文锋，等.用静脉留置针插大鼠股动脉建立有创监测血压模型.热带医学杂志，2010，10(7):794-796.

［4］Hidenori Endo，Hiroshi Kamada，Chikako Nito，et al.Mitochondrial Translocation of p53Mediates Release of Cytochrome c and Hippocampal CA1Neuronal Death after Transient Global Cerebral Ischemia in Rats.J Neurosci，2006，26(30):7974-7983.

［5］Smith M L，Bendek G，Dahlgren N，et al.Models for studyinglongterm recovery following forebrain ischemia in the rat.2.A 2-vessel occlusion model.Acta Neurol Scand，1984，69(6):385.

［6］张綦慧，张允岭，陈志刚，等.脑缺血动物模型研究进展.辽宁中医杂志，2001，37(8):1618-1619.

Improvement of two vessel occlusion plus hypotension method in global brain ischemia model of rats

WU Zhao，HUANG Wei-qing，WEN Rui-ling，et al.The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510288，China

ObjectiveTo establish the global cerebral ischemia/reperfusion model by the means of two vessel occlusion add hypotension，study changes of the global cerebral structure in rats.To provide conditions for the research of further nerve protection in the recovery of brain.MethodsEstablish the global cerebral ischemia-reperfusion model in 16SD rats by two-vessel occlusion plus hypotension.Calculate the number of alive cases and death cases，and make a craniotomy for cerebral tissue from morphological observation at the end of the experiment.Results14rats modeling success of the 16rats，whose success rate was 87.5%.Obvious pathological lesions of nerve cells including neuronal necrosis，concentrated neuronal cytoplasma and karyopycnosis are observed in global cerebral ischemia-reperfusion rats.ConclusionThe two vessel occlusion plus hypotension method has a steady effect and a lower mortality of modeling.It can better establish global cerebral ischemia/reperfusion model of in rats，which can provide a good experimental basis for the recovery of the brain research.

Two vascular occlusion;The global cerebral ischemia/reperfusion;Invasive blood pressure monitoring

广州市大学生科技创新实践项目基金与广州市大学生特色项目基金(项目编号:2011-06)

510120广州医学院第一附属医院

黄伟青