瓜类果斑病菌致病基因及靶标基因的预测

严婉荣， 王铁霖， 戴良英， 杨玉文， 王建玉， 赵廷昌＊

（1.湖南农业大学生物安全科学技术学院，长沙 410128；2.中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193；3.新疆兵团农六师农科所，五家渠 831300）

瓜类果斑病菌致病基因及靶标基因的预测

严婉荣1， 王铁霖2， 戴良英1， 杨玉文2， 王建玉3， 赵廷昌2＊

（1.湖南农业大学生物安全科学技术学院，长沙 410128；2.中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193；3.新疆兵团农六师农科所，五家渠 831300）

哈密瓜果斑病是严重危害瓜类的种传细菌性病害，其病原菌为嗜酸菌属西瓜种（Acidovoraxcitrulli）。本文首先用Bioedit软件建立瓜类果斑病菌全氨基酸序列本地资源库，运用比较基因组学的方法，通过大量查找嗜酸菌属、欧文氏菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属、劳尔氏菌属、土壤杆菌属、木质部小菌属中的致病基因和参考文献中已报道的致病基因，下载相关致病基因的氨基酸序列，与瓜类果斑病菌的全氨基酸序列进行localblast，取E＜10－5的为候选基因，得到果斑病菌中与致病性相关的基因，并对未知蛋白进行产物预测。同时，根据已经公布的靶标基因，用同样的比对方法，得到果斑病菌中潜在的靶标基因。本研究通过保守估计，得到77个致病性相关蛋白，预测了其中7个未知蛋白的产物，得到46个靶标蛋白。致病基因和靶标基因的分析预测，对以后研究此类基因提供了指导作用，为更好地防治该病害提供了理论基础。

瓜类果斑病菌； 致病基因； 靶标基因

植物与病原互作的结果决定于各自所带的基因。目前，已知的植物病原细菌的致病因子主要有胞外多糖、脂多糖、胞外酶、植物毒素和Ⅲ型效应物［1－2］。除了常见的过敏性反应和致病性基因hrp（hypersensitive reaction and pathogenicity gene）基因簇和无毒基因外，还有其他的基因与致病性相关。如在欧文氏软腐病菌中，opgGH葡聚糖合成基因：葡聚糖（OPG）是革兰氏阴性细菌细胞膜表面的成分，具有调节渗透压的作用，突变时致病性丧失，胞外酶合成能力降低、胞外葡聚糖合成过剩和侵染性降低；sodA过氧化物歧化酶基因：突变体降低菌的毒性，通过转换H2O2抵消过氧化物阴离子的作用；msrA甲硫氨酸还原酶基因：编码还原被氧化蛋白的酶［3］；水稻条斑病菌和白叶枯病菌中，wxocA、wxocB、wxocD、wxocE和wzt是水稻条斑病菌（Xanthomonasoryzaepv.oryzicola，Xooc）的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）合成基因，基因wxocB、wxocE和wzt与致病性有关，前两基因的突变导致细菌完全失去毒性，而后一基因的突变导致细菌部分丧失毒性［4］。

药物靶标是指药物在生物体内的作用结合位点，它可以是基因位点、受体、酶、离子通道、核酸等生物大分子。现在对植物致病菌潜在靶标的研究非常少，植物致病菌的药物靶标的个数更是少之又少。高娜等根据人类抗菌药物靶标名称和序列信息在16个植物致病菌基因组中进行查找，依据靶标名称分类，在植物致病菌中共发现人类抗菌药物靶标54种850个［5］。

本研究尝试利用比较基因组的方法对植物病原细菌AcidovoraxcitrulliAAC00－1全基因组进行致病基因和靶标基因的预测分析。

1 材料和方法

1.1 试验材料

从 NCBI（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov／nuccore／NC＿008752）上 获 得AcidovoraxcitrulliAAC00－1的全基因组序列、氨基酸序列和ORFs的功能注释等相关信息。

主要网络资源：NCBI（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov／），KEGG（http：∥www.genome.jp／kegg／），COG（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov／sutils／coxik.cgi？gi＝20243）。

软件：Bioedit，Excel。

1.2 预测方法

从NCBI上获得瓜类果斑病菌全基因组的氨基酸序列，用BioEdit建立该序列的本地资源库；

搜索大量的文献资料，筛选出经过验证与细菌致病性相关的基因，查询KEGG数据库和NCBI数据库，下载氨基酸序列。

利用生物信息学的方法，将下载到的与致病性有关的氨基酸序列与果斑病菌全基因组氨基酸序列进行localblast［6－22］，比对结果的参考标准：E＜10－5时，认为该基因和比对的基因具有同源性，分类整理这些基因，同时预测未知蛋白的产物。

根据已公布的靶标基因信息［23］，下载到相关靶标基因，用同样的方法进行localblast，搜索整理获得瓜类果斑病菌潜在靶标基因。

2 结果

2.1 致病基因

推测获得瓜类果斑病菌基因组中致病性相关基因，并按其基因注释的功能进行分类，结果见表1。

表1 预测致病基因分类1）

在果斑病菌中，有些基因的产物是未知的，通过与其他致病基因比对，在比对结果中有7个未知产物且有同源性的基因，并对未知产物进行预测，其中致病性基因的来源注释如下，蛋白编号指果斑病菌中未知产物的蛋白编号，结果如表2。

表2 未知蛋白产物预测

2.2 靶标基因

根据已有的植物致病菌靶标信息［5］，比对预测瓜类果斑病菌基因组中潜在的靶标基因，如表3所示。

表3 潜在靶标基因信息

续表1

3 讨论

比较基因组学（comparative genomics）是基于基因图谱和测序基础上，对已知的基因和基因组结构进行比较，来了解基因的功能、表达机理和物种进化的学科。已测序的革兰氏阴性植物致病菌主要有以下几类：嗜酸菌属（Acidovorax）：瓜类细菌性果斑病菌（AcidovoraxcitrulliAAC00－1）；土壤杆菌属（Agrobacterium）：根癌土壤杆菌 （Agrobacterium tumefaciensstr.C58）；棒形杆菌属（Clavibacter）：番茄细菌性溃疡病菌（Clavibactermichiganensissubsp.michiganensisNCPPB 382）；欧文氏菌属（Erwinia）：胡萝卜软腐欧文氏菌（Erwiniacarotovorasubsp.atrosepticaSCRI1043）；假单胞菌属（Pseudomonas）：菜豆晕疫病菌（Pseudomonassyringaepv.phaseolicola1448A）、丁香假 单胞菌（Pseudomonassyringaepv.syringaeB728a）、番茄细菌性斑点病菌（Pseudomonassyringpv.tomatostr.DC3000）；青枯病菌属（Ralstonia）：茄科劳尔氏菌（RalstoniasolanacearumGMll000）；黄单胞菌属（Xanthomonas）：柑橘溃疡病菌（Xanthomonasaxonopodispv.citristr.306）、白菜黑腐病菌（Xanthomonascampestrispv.campestrisstr.8004，Xanthomonascampestrispv.vesicatoriastr.ATCC 3391）、番茄疮痴病菌（Xanthomonascampestrispv.vesicatoriastr.85－10）和水稻白叶枯病菌（Xanthomonasoryzaepv.oryzaeKACC10331，Xanthomonasoryzaepv.oryzaeMAFF 311018）；木质部小菌属（Xylella）：苛养木杆菌（Xylellafastidiosa9a5c，XylellafastidiosaTemecula1）。这些完成测序的基因组为比较基因组分析提供了大量的材料，成为通过全基因组方法研究基因和蛋白功能的新方法。

通过保守估计，比对的结果得到了36个与Ⅲ型分泌系统有关的基因；3个无毒基因；11个毒性基因；10个非寄主适应性基因；2个胞外多糖基因；2个表面蛋白基因；1个细胞壁降解基因；12个其他类型的基因。但是果斑病菌中与致病性相关的基因远远不止这些。同时发现hrp基因中蛋白编号为YP＿968830的基因已经被证实过是与致病性相关的hrcR基因［24］；根据丁香假单胞菌番茄致病变种（Pseudomonassyringaepv.tomato）DC3000中新的毒性基因tvrR（TetR－like virulence regulator）的氨基酸序列，从瓜类细菌性果斑病菌（AcidovoraxcitrulliAAC00－1）的全基因组中发现并克隆了tvrR基因的同源物，致病性试验结果显示：突变体比野生型的病程延长，但最终致病情况与野生型无差异。而在比对所得的毒性基因中也没有发现与该基因有关的蛋白［25］。说明比较基因组学在预测致病性基因方面的可靠性，同时也进一步说明了本文所预测的致病性基因在很大程度上是与致病性有关的。

通过从7个植物病原细菌54个潜在的靶标基因中，预测得到了46个果斑病菌中潜在的靶标基因，从致病性基因和靶标基因的比对结果可以看到，得到的所有蛋白序列都集中在YP＿960000～YP＿970000之间，说明与果斑病菌致病性相关的基因在空间上都是在这10000个基因当中分布，就像hrp基因簇是在一个小空间成簇分布一样，所有与致病性有关的基因是在一个相对大的空间内分布。可见，靶标基因也具有一定的保守性。

果斑病作为一种较新的种传细菌病害，其药剂防治效果不理想，品种的抗性不强，发病范围逐年扩大，让我们不得不重视其潜在的危害性。植物病原细菌对寄主植物的致病过程极其复杂，一般经过接触、识别、侵入、定殖、扩展和发病6个阶段。其中的每一步都有相应的基因参与，这些基因有的参与营养的获取，有的影响信号的传导，有的影响蛋白的分泌。在多数情况下，寄主编码的抗病基因（R）产物识别有病菌编码的无毒基因（avr）产物，这种互作触发一个快速的防卫反应，即非亲和反应，病原菌被限制在初侵染位点。病菌avr基因只有在hrp基因参与的情况下才能诱发植物产生非亲和反应。当病菌中缺少适合的avr基因或者寄主植物中缺少R基因，都将会导致亲和性互作，这种情况下，病菌通过向植物分泌胞外酶、胞外多糖及其他致病因子，克服植物固有的防卫机制，使植物发病。目前，对该病害分子机制方面的研究较少，本论文应用生物信息学的方法，保守定位致病基因和靶标基因，为以后研究致病基因的致病性和靶标基因的作用机理缩小了范围，对以后该病害的防治和新药的研发有一定的帮助。本文只是初步对致病基因进行了预测，对于其是否真正具有致病性还有待进一步研究。

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Prediction for pathogenic genes and target genes inAcidovoraxcitrulli

Yan Wanrong1， Wang Tielin2， Dai Liangying1， Yang Yuwen2， Wang Jianyu3， Zhao Tingchang2
（1.CollegeofBio－safetyScience＆Technology，HunanAgriculturalUniversity，Changsha410128，China；2.StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsect Pests，InstituteofPlantProtection，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China；3.InstituteofAgriculturalResearch6thBranchofXPCG，Wujiaqu831300，China）

The melon fruit blotch transmitted by seeds is a serious hazard melon bacterial disease，the pathogen of which isAcidovoraxcitrulli.This study was conducted firstly through establishing a local resource library of whole amino acid sequences of the melon fruit blotch by Bioedit software.Subsequently，the method of comparative genomics was used to search for the pathogenic genes and reference pathogenic genes previously reported inAcidovorax，Erwinia，Pseudomonas，Xanthomonas，Ralstonia，AgrobacteriumandXylellaby downloading the relevant amino acid sequences of pathogenic genes and doing local blast with the melon fruit blotch pathogen full amino acid sequence.Taking the genes withE＜10－5as the candidates，we tried to obtain pathogenesis－related genes of melon fruit blotch，and predicted the unknown protein products.Meanwhile，according to the published target genes，the potential target genes were predicted by using the similar method.By conservative estimation，77 pathogenesis－related proteins were obtained，among which7 unknown protein products were predicted.And 46 target proteins were acquired in this study.Analysis of pathogenic genes and target genes can provide a guidance for further research and a theoretical basis for preventing the disease.

melon fruit blotch； pathogenic gene； target gene

S 432.42

A

10.3969／j.issn.0529－1542.2012.05.020

2011－11－15

2012－03－09

公益性行业（农业）科研专项（201003066）；国家西甜瓜产业技术体系（CARS－26）

＊ 通信作者E－mail：tczhao＠ippcaas.cn