高效液相色谱柱后衍生法测定农田沟渠水中草甘膦残留

王 聪， 刘颖超＊， 庞民好， 董金皋

（1.河北农业大学植物保护学院，保定 071000；2.河北农业大学真菌毒素与植物分子病理学实验室，保定 071000）

高效液相色谱柱后衍生法测定农田沟渠水中草甘膦残留

王 聪1， 刘颖超1＊， 庞民好1， 董金皋2＊

（1.河北农业大学植物保护学院，保定 071000；2.河北农业大学真菌毒素与植物分子病理学实验室，保定 071000）

为了准确评价草甘膦在农田沟渠水中使用后其对生态环境的安全性，建立了高效液相色谱（HPLC）－柱后衍生法对农田沟渠水中草甘膦残留量的检测方法。将田间沟渠水样中草甘膦经次氯酸钠和邻苯二甲醛、巯基乙醇衍生化后，采用荧光检测器检测。衍生剂1（5%）次氯酸钠添加量100μL／L；衍生剂2硼酸钾和OPA添加量分别是130g／L和100mg／950mL。草甘膦在0.05～2mg／L范围内线性良好，相关系数为0.999 9。在农田沟渠水中，草甘膦3个添加水平（0.05、0.5、1mg／L）的平均回收率（n＝5）为98.2%～104.4%，5次测量的相对标准偏差为2.1%～3.6%，方法检出限为0.05mg／L。该方法灵敏、简便、快速，适合于农田沟渠水中草甘膦残留量的检测。

高效液相色谱； 柱后衍生； 农田沟渠水； 草甘膦

草甘膦（glyphosate，分子式为C3H8NO5P，化学结构见图1）属灭生性输导型茎叶处理剂，具有广谱、高效、低毒、低残留的特点。农业生物技术应用国际服务组织 （ISAAA）最新统计报告，2009年全世界转基因作物（大豆、玉米、苜蓿等）种植面积已达1.34亿hm2。随着转基因作物大面积种植，草甘膦在世界除草剂应用中越来越受到人们的欢迎，广泛用于农田各种杂草的防除和非农田杂草的治理，现已成为应用最广、产量最大的除草剂品种［1－2］。然而，草甘膦的大量使用对环境造成的影响是不可忽视的。草甘膦对人畜低毒，一直以来被认为是“安全”的除草剂，但近些年的研究显示环境中的草甘膦能够造成大量益虫死亡，对水生生物也具有极强的毒性［3］。朱国念等通过室内外试验，探索了草甘膦对水蚤、藻类和鱼的毒性效应以及在水中的残留动态［4］。此外，草甘膦还能够使土壤中的微生物种群比例发生改变，造成一些有益微生物活性降低，土壤有机质含量下降，从而降低土壤的质量。邓晓等研究表明草甘膦对土壤微生物的种群数量及土壤中细菌、放线菌和真菌生长速率均具有一定的抑制作用［5］。这些研究为保障生物生存环境的安全提供了科学依据。

图1 草甘膦的化学结构示意图

虽然草甘膦在防除杂草方面发挥着良好的作用，但由于其易溶于水，难溶于一般有机溶剂，缺少发色团和荧光团，对其分析测定难度很大［6］，尤其在环境中有其他常见化合物存在情况下，进行痕量测定愈加困难［7］。目前，测定草甘膦的方法主要有气相色谱法［8］、气相色谱－质谱法［9］、高效液相色谱－串联质 谱 法［10］、高效液 相 色 谱 法［11－14］、离 子 色 谱法［15］、分光光度法［16］、毛细管电泳法［17］等，但这些方法均具有局限性。例如：气相色谱法操作步骤繁琐，重现性差，同时限制了常用的各种标准衍生技术；气相色谱－质谱联用法灵敏度高，但成本高且普及率低，前处理繁琐，不利于大批量样品处理；分光光度法检测的灵敏度低，干扰性大；柱前衍生高效液相色谱法中的柱前衍生试剂易与水反应生成副产物，并且有些衍生试剂毒性较大［10］。为了快速、准确、高灵敏度测定农田沟渠水中草甘膦的残留，本文建立了高效液相－柱后衍生法测定农田沟渠水中草甘膦含量的方法，试验证明了该方法灵敏度和精确度高，干扰少且成本相对低，重现性好，能直接进样测定，适合于大批量样品的检测。

1 材料与方法

1.1 仪器

高效液相色谱系统（美国Agilent公司）：包括脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、荧光检测器（FLD）；PCX5200柱后衍生仪配二元泵（美国Pick－ering Laboratories公司）；科导SK2210LHC超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；SK－1快速混匀器（上海沪粤科学仪器有限公司）。

1.2 试剂

99%草甘膦标准品（上海江莱生物科技有限公司）；磷酸，氢氧化钾，次氯酸钠，氯化钠，氢氧化钠，磷酸二氢钾，硼酸钾，以上均为国产分析纯；甲醇，巯基乙醇（色谱级，美国 Pickering Laboratories公司），邻苯二甲醛（OPA，化学纯，国药集团化学试剂有限公司），超纯水（自制），甘氨酸（Amresco）。

1.3 溶液的配制

流动相：钾洗脱液（0.4%磷酸－0.1%磷酸二氢钾水溶液；pH＝2）；再生液（0.3%氢氧化钾水溶液）；

衍生试剂1：5%次氯酸钠100μL，加入950mL GA116（1% 氯化钠，0.1%磷酸二氢钾，0.1%氢氧化钠水溶液；pH＝12）；

衍生试剂2：100mg OPA用10mL甲醇溶解，同时与2mL巯基乙醇加入到950mL的GA104（13%硼酸钾的水溶液；pH＝9.8）中，使用前通氮气去氧（10～15min）。

1.4 HPLC－柱后衍生测定条件

1.4.1 色谱柱

分析柱：钾阳离子交换柱（50×4.0mmi.d.），保护柱：钾阳离子交换柱（20×3.0mmi.d.）（美国Pickering Laboratories公司）。

1.4.2 柱后衍生条件

进样体积：10μL；流动相流量：0.4mL／min；衍生剂1流速：0.3mL／min；衍生剂2流速：0.3mL／min；柱温：55℃；柱后衍生反应器温度：36℃；

检测器：荧光检测器设定的激发波长λEX＝330nm，发射波长λEM＝465nm。梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱和流速

1.5 样品处理

采集不少于1kg农田沟渠水样品，4层纱布过滤，准确量取25.0mL滤液于50mL离心管中，5 000r／min离心30min，上清液用滤纸过滤，滤液过0.22μm滤膜后进行检测。

2 结果与分析

2.1 衍生化条件的选择

2.1.1 衍生剂1中次氯酸钠对衍生效率的影响

衍生剂1是由氯化钠、磷酸二氢钾、氢氧化钠、次氯酸钠组成的体系，该体系的pH＝12。在同一个草甘膦浓度下，设定5%次氯酸钠的7个添加量，在1 000mLGA116中，分别添加40、60、80、100、120、140、160μL进行测定（图2）。可以看出，次氯酸钠的量影响衍生效果。当添加量小于80μL时，随着次氯酸钠添加量的增加，响应值逐渐增大；当大于80μL时，随着次氯酸钠添加量的增加响应值基本不发生变化。因此选取100μL作为后继试验的添加量。

图2 次氯酸钠量的选择

2.1.2 衍生剂2中OPA、硼酸钾对衍生效果的影响

衍生剂2由硼酸钾、邻苯二甲醛（OPA）、巯基乙醇的体系组成。固定邻苯二甲醛、巯基乙醇的量，改变反应缓冲液中硼酸钾的盐浓度，向1 000mL溶液中分别添加20、30、40、60、80、100、130g硼酸钾进行测定（图3）。草甘膦浓度相同时，随着硼酸钾添加量的增加，响应值逐渐增大；添加量为130g／L时，硼酸钾在水中达到了饱和，此时响应值最大。因此选取130g／L作为后继试验的添加量，此时溶液的pH＝9.8。

图3 硼酸钾浓度的选择

OPA添加量的设置：在GA104分别添加40、60、80、100、200、250、300mg OPA进行测定（图4）。可以看出，草甘膦浓度相同时，OPA添加量的多少影响衍生效果，OPA添加量高于80mg后，响应值开始趋于平稳，因此选择100mg／950mL作为添加量。

以上试验结果表明，草甘膦衍生反应效率受多个因素的影响，本试验所涉及的因子中，流动相的组成百分比及pH，次氯酸钠和硼酸钾等的反应量均与衍生效率密切相关。

图4 邻苯二甲醛浓度的选择

2.2 标准曲线的绘制

配制草甘膦标准液浓度为 0.05、0.1、0.5、1.0mg／L和2.0mg／L；以峰面积定量y对浓度x（mg／L）进行回归分析，草甘膦的回归方程为y＝36.464x＋0.221 1，相关系数R2＝0.999 9。

2.3 方法的准确度、灵敏度和精密度

方法的准确度可用添加回收率表示。在农田沟渠水中设置3个添加水平：0.05、0.1、1mg／L。每个添加水平平行测定5次，平均回收率98.2%～104.4%；相对标准偏差（RSD）2.1%～3.6%（表2）。以农田沟渠水的最低添加量作为检出限0.05mg／L。达到农药残留分析对灵敏度的要求。农田沟渠水的空白和添加草甘膦样品谱图见图5。由图5可知，0.05mg／L和1mg／L草甘膦分别在农田沟渠水中的添加回收率的峰形较好。

表2 农田沟渠水草甘膦的添加回收率

图5 空白样品和草甘膦加标样品色谱图

3 结论与讨论

本文确立了农田沟渠水中草甘膦的高效液相色谱柱后衍生检测方法。草甘膦在0.05～2mg／L范围内线性关系良好，相关系数为0.999 9，添加水平为0.05～1mg／L的平均回收率为98.2%～104.4%，相对标准偏差为2.1%～3.6%，方法检出限为0.05mg／L。中国草甘膦 MRL值为0.5～1mg／L，本方法能满足农田沟渠水中草甘膦的残留量检测。

试验过程中发现，使用不同批次配制的流动相，草甘膦的保留时间会略有变化，但对测定结果不产生影响。根据柱后衍生原理，甘氨酸可能对草甘膦测定产生干扰，因此采用本文建立的方法对甘氨酸进行了测定。结果表明，本试验中甘氨酸对草甘膦的测定不产生干扰作用。

高效液相色谱柱后衍生法检测草甘膦是通过色谱柱将草甘膦与杂质分离，柱后衍生系统将其在线衍生为异吲哚物质，荧光检测器检测，灵敏度高。农田沟渠水经过沉淀过滤即可直接进样检测，处理方法简单。结合自动进样器能大批量自动衍生检测样品，省工省时。同时在线衍生避免了柱前人工衍生造成的误差，精密度高。常规柱前衍生反应需控制在一定时间内，不易大批量衍生样品，并且柱前衍生应用的衍生试剂邻硝基苯磺酰氯、二硝基氟苯等毒性大，在开放环境的操作过程对人体危害大［10，18］。而柱后衍生试剂是封闭系统中在线自动完成，对人体危害小。

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Determination of glyphosate in the water of farmland ditch by high performance liquid chromatography－post column derivation

Wang Cong1， Liu Yingchao1， Pang Minhao1， Dong Jingao2
（1.CollegeofPlantProtection，AgriculturalUniversityofHebei，Baoding071000，China；2.MycotoxinandMolecularPlantPathologyLaboratory，AgriculturalUniversityofHebei，Baoding071000，China）

In order to accurately evaluate the bio－environmental safety of glyphosate，a HPLC－post column derivation method was developed to determine glyphosate in the water of farmland ditch.Glyphosate in the water of farmland ditch was derivatized with the sodium hypochlorite，o－phthalic aldehyde and mercaptoetha－nol，which were detected withfluorescence detector.The 5%sodium hypochlorite volume of derivative 1 was 100μL／L；potassium borate and OPA volumes of derivative 2 were 130 g／L and100 mg／950 mL，respectively.The linearities of glyphosate were at the concentration range of 0.05 to 2.0mg／L，with a correlation coefficient of 0.999 9.The mean spiked recoveries of glyphosate at 3 spiked levels ranged from98.2%to 104.4%.The relative standard deviations（RSD，n＝5）were 2.1%－3.6%.The limit of detection was 0.05 mg／L.This method is sensitive，simple，rapid and suitable for determining glyphosate in the water of farmland ditch.

high performance liquid chromatography； post column derivation； the water of farmland ditch；glyphosate

TQ 450.263

A

10.3969／j.issn.0529－1542.2012.05.019

2011－11－24

2011－12－26

现代农业产业技术体系专项基金（CARS－02）

＊ 通信作者E－mail：liuyingchao＠hebau.edu.cn，dongjingao＠126.com