大豆异黄酮对心理应激所致小鼠卵巢氧化损伤的保护作用

肖卫荣 ，袁照清 ，余玉珍 ，徐良全 ，邹文斌

（1.丰城市妇幼保健医院妇产科，江西 丰城 331100；2.万载县中医院妇产科，江西 万载 336100；3.南昌大学医学实验教学部，南昌 330006；4.丰城市人民医院医务科，江西 丰城331100）

卵巢储备功能是指卵巢内存留卵泡的数量和质量，能反映女性的生育潜能和生殖内分泌功能。卵巢储备功能下降（decreasing ovarian store，DOS），可导致女性生育能力减弱及性激素缺乏，进一步发展为卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）。近年来，随着社会经济、文化、生活环境、工作节奏等的改变，DOS发病率有逐年上升趋势，严重影响着女性的生殖健康和生活质量。以往研究[1-2]表明，应激可以通过影响内分泌从而影响生殖功能。至于长期心理应激条件下，是否会导致卵泡细胞的氧化损伤，国内外均未见报道。本研究通过建立动物的应激模型，并进行大豆异黄酮（soy isoflavones，SI）干预处理。同时，通过测定小鼠卵巢中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物（glutathione peroxi-dase，GSH-Px）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的变化，探究心理应激对卵巢氧化损伤作用及其损伤机制，明确心理问题对女性生殖健康的影响，为妇女更年期的推迟及卵巢早衰的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

选取刚刚性成熟的健康雌性昆明小鼠50只，体质量18～22 g，由南昌大学实验动物中心提供。喂养普通饲料，自由饮水。动物房温度控制在（24±1）℃，湿度为 40%～70%，光∶暗周期为 12 h∶12 h。适应喂养3 d后，按随机数字表法分为5组：对照组、应激模型组、SI低剂量组 （83 mg·kg-1）、SI中剂量组（167 mg·kg-1）和 SI高剂量组（333 mg·kg-1），每组 10 只小鼠。SI组应激的同时给与SI处理。SI各组每日按2%（即 2 mL·100 g-1）给予相应剂量的 SI，用 0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）配制成混悬液灌胃；应激模型组和对照组每日给予等体积0.5%CMC-Na溶液灌胃。连续30 d。

1.2 心理应激动物模型的建立

参照文献[3]的方法，SI组及应激模型组小鼠以束缚为应激原建立心理应激动物模型。使用50 mL离心管（图1），在离心管管壁前端扎数个孔，保证空气通畅。在离心管盖子上钻孔，待小鼠钻入离心管后，盖上离心管盖子，将小鼠尾部暴露在外面，封闭后的离心管固定于水平桌面上。每天09:00开始，15:00解除，束缚持续30 d。

1.3 检测指标及方法

图1 束缚应激模型

1.3.1 血清皮质醇测定

在末次束缚应激24 h后，取小鼠眼眶血分离血清，采用皮质醇放射免疫分析测定盒（北京四环生物技术有限公司）检测血清中的皮质醇含量。

1.3.2 SOD、GSH-Px活性和 MDA含量测定

分别摘取各组小鼠卵巢。称重后，按1∶9的比例与冷生理盐水混合，制成10%的匀浆。离心后，取上清液，按试剂盒（南京建成生物工程研究所)要求测定SOD、GSH-Px活性及MDA含量。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 各组小鼠血清皮质醇分泌的变化

应激模型组及SI低剂量组皮质醇水平明显高于对照组（均P＜0.05)；与对照组相比，SI中高剂量组皮质醇虽然有升高，但是差异无统计学意义（P＞0.05），SI各剂量组血清皮质醇较应激模型组低（P＜0.05），其中SI中剂量皮质醇水平降低最明显。见表1。

2.2 各组小鼠卵巢SOD、GSH-Px活性及MDA含量的变化

各应激组小鼠卵巢组织中SOD、GSH-Px活力均低于对照组，MDA含量均高于对照组（均P＜0.05）；与应激模型组相比，SI各剂量组小鼠卵巢组织中SOD、GSH-Px 活力均明显升高（均 P＜0.05），MDA 含量均明显降低（均P＜0.05），其中以SI中剂量组效果最为明显。见表1。

表1 各组小鼠血清皮质醇水平及卵巢SOD、GSH-Px活性和 MDA含量的变化 ±s

表1 各组小鼠血清皮质醇水平及卵巢SOD、GSH-Px活性和 MDA含量的变化 ±s

*P＜0.05与对照组比较，△P＜0.05与应激模型组比较，#P＜0.05与SI中剂量组比较。

MDA/（nmol·mgprot-1）对照组 10 257.26±1.51 175.86±13.51 126.86±8.65 0.356±0.05应激模型组 10 275.86±1.21* 136.43±12.21* 78.24±12.15* 0.615±0.03*SI低剂量组 10 270.16±1.21*△ 148.79±15.21*△# 89.02±6.82*△# 0.515±0.08*△#SI中剂量组 10 259.47±1.48△ 169.56±10.23*△ 115.35±8.65*△ 0.337±0.12*△SI高剂量组 10 263.02±1.23△ 156.14±15.48*△# 94.36±8.65*△# 0.428±0.13*△#组别 n 血清皮质醇ρ/（ng·mL-1）SOD/（NU·mgprot-1）GSH-Px/（活力单位·mgprot-1）

3 讨论

心理社会因素是现代社会中重要的应激源。长期应激时，下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA）持续激活，皮质醇大量释放。同时，交感神经系统（SNS）兴奋，交感神经末梢和肾上腺髓质释放儿茶酚胺增加，导致机体的稳态失衡。另外，应激条件下产生的许多活性氧和自由基，对组织细胞产生不可逆的氧化应激损伤。

氧自由基，统称为活性氧（reactive oxygen species，ROS）。ROS是需氧生物在自身的新陈代谢过程中，由于受到内外环境的刺激而在其机体内持续产生的活性产物，包括超氧阴离子（O2-·）、羟自由基（OH·）、氢过氧化物（H2O2）及单线态氧等。 ROS 因含有未成对电子,所以极不稳定,容易与其邻近分子反应，并可诱发产生新的自由基，一般情况下可以参与机体的物质代谢和信号转导，对细胞的正常代谢起着重要作用。ROS的产生会受到体内抗氧化防御系统的调节，从而保持在平衡的健康状态。当自由基产生过多或自由基通过内源性的抗氧化成分进行清除减少，如SOD和GSH-Px等出现故障，体内氧自由基代谢就会出现失衡，导致自由基蓄积过多，攻击机体，则对组织细胞产生不可逆损伤，氧化应激即发生,造成蛋白质损伤、脂质过氧化、DNA改变、酶失活等,发生包括癌症、心血管疾病、风湿性关节炎、感染等多种病变[4-5]。

最近的研究发现，心理应激可以导致卵巢储备功能下降[6]，其可能的机制是否与氧化应激损伤有关呢？本实验研究证实了笔者的设想，实验中发现各应激组小鼠卵巢组织中SOD、GSH-Px活力均较对照组明显偏低，MDA含量较对照组明显升高，说明应激可以导致小鼠卵巢的氧化损伤。

SI是从大豆中分离提取的一类多酚化合物，具有防癌、抗衰老、抗氧化、防治骨质疏松、调节细胞的基因表达及抑制细胞凋亡等作用[7-11]，主要包括大豆黄酮、大豆黄酮甙、染料木素和染料木甙。SI与内源性雌激素有相似的分子结构,能与雌激素α、β 2 种受体（Erα、Erβ）结合，发挥雌激素样作用[12]。 本实验中发现，应激的同时给予SI干预，其血清皮质醇水平明显降低，其机制就是SI具有拟雌激素的作用，通过直接或间接影响HPA功能，维持内环境的稳定，从而抑制皮质醇的释放。另外，SI的各主要成分均是天然抗氧化剂，能刺激抗氧化酶合成并增加其活性。同时，清除体内活性氧自由基、减少脂质过氧化物的产生。体内外实验[13-15]均表明，SI能够通过直接清除活性氧和间接的抗氧化作用使心肌细胞培养基中的MDA含量降低。J.S.Lee[16]发现，染料木黄酮可以显著提高糖尿病大鼠肝脏抗氧化酶包括SOD、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性。C.Borras等[17]用染料木黄酮孵育人乳腺瘤细胞系（MCF-7）48 h，发现该细胞的 Mn SOD mRNA 含量显著增高。SOD的唯一生理功能是歧化 O2-·，它可以促进 O2-·的歧化反应，清除O2-·的毒性作用，减轻和防止脂质过氧化作用，SOD活性增强可以保护细胞不受自由基的损害。本研究发现：与应激模型组相比，SI各亚组小鼠卵巢组织中SOD、GSH-Px活力均明显升高，MDA含量均明显降低。表明SI可以对抗或降低应激所致的小鼠卵巢的氧化损伤。

总之，SI所具有的抗氧化作用能淬灭体内异常增多的自由基、减少脂质过氧化产物、增加抗氧化酶的活性，具有很好的开发价值。

本实验系在南昌大学医学院生殖研究所内完成，并得到南昌大学医学院徐良金老师的大力指导，在此表示感谢！

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