Er：YAG 激光与车针备洞对兔牙髓组织影响的对比研究

汪建中，陈 鹏，何宏玉

（1.江西省人民医院口腔科；2.南昌大学研究生院医学部a.2009级；b.2010级，南昌 330006）

目前，高速手机车针是临床日常切割牙体硬组织的工具，由于车针的震动、噪音、产热等因素易使患者产生酸痛、恐惧等症状。因此，寻求一种新的更好的切割工具是口腔医学界一直以来在探索的问题。Er:YAG激光作为一种性能优良的切割牙体硬组织激光现已成为关注的热点，本文分别采用Er：YAG激光与车针对兔牙备洞，观察、比较2种方法对兔牙髓组织的影响，旨在为临床应用Er：YAG激光备牙提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

日本大耳白兔48只，雄性，3月龄，体质量2.0～2.5 kg，由南昌大学实验动物科学部提供。

1.2 主要试剂和仪器

HSP70单克隆抗体、SABC免疫组化染色、试剂盒及DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），HANS-MDWL6激光治疗机（中国大族激光科技股份有限公司）、PANA-MAX高速手机（日本NSK集团有限公司）、RM2135徕卡组织切片机（德国LETCA仪器有限公司）、BX40F4奥林巴斯光学显微镜（日本奥林巴斯有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组

将48只日本大耳白兔随机分为3组：对照组（A 组）、Er:YAG 激光组（B 组）和车针组（C 组），每组16只。

1.3.2 实验动物模型建立

B组：3%戌巴比妥钠兔耳缘静脉注射麻醉（30 mg·kg-1），用Er:YAG激光对兔下颌右侧中切牙牙冠唇面颈1/3中点处行直径2 mm、深0.5 mm的窝洞制备，采用波长 2 940 nm，功率 6 W，水∶气＝1∶1，光斑直径为2 mm的Er:YAG激光治疗机，激光束距牙表面1 mm连续射击10 s备洞。备洞后即刻用玻璃离子（富士Ⅱ）充填。

C组：麻醉同B组前，选择直径2 mm的柱状金钢砂标记车针对兔下颌右侧中切牙牙冠唇面颈1/3中点处行直径2 mm、深0.5 mm的窝洞制备。备洞时间控制在10 s内，备洞后即刻用玻璃离子（富士Ⅱ）充填。

A组：不做任何处理。

1.3.3 标本和组织切片制备

3组分别在备洞后24 h、3 d、7d和14 d时各处死4只兔，取出实验牙，立即置于10%福尔马林溶液内，室温下固定24 h，去除舌侧牙体硬组织完整取出牙髓，梯度酒精脱水，石蜡包埋，行5 μm厚的连续纵切片（沿长轴），取标本纵载面积较大的切片2张，置于40℃水溶中，一张常规HE染色低倍（×100）光镜观察，另一张待做免疫组化染色（ICH）。

1.3.4 ICH诱导型HSP70测定

按ICH、显色试剂盒的操作要求对切片进行染色、显色，在高倍（×400）光镜下，采用双盲法阅片，每张切片中央区与4个边缘区随机选取5个视野观察诱导型HSP70的阳性表达。

1.3.5 ICH结果的判定

牙髓组织细胞核或胞质内出现棕黄色定为诱导型HSP70阳性，根据染色程度可将ICH结果分为4级：细胞内无染色为阴性（－），淡黄色为弱阳性（+），棕黄色为中度阳性（），棕褐色为强阳性（）。

2 结果

2.1 HE染色结果

A组：各时间点牙髓组织无异常，无炎症表现。

B组：激光备洞后24 h时出现成牙本质细胞层排列轻度紊乱，血管轻度扩张，髓腔内发现少量炎症细胞；3 d时有部分成纤维细胞增生，血管轻度扩张，较多的炎症细胞浸润；7 d时可见成牙本质细胞重新排列，已无血管扩张表现，少许的炎症细胞浸润；14 d时牙髓成牙本质细胞层排列整齐，成纤维细胞分布均匀，血管恢复正常，无炎症细胞浸润。

C组：车针备洞后24 h时成牙本质细胞层排列紊乱，结构发生变化，血管扩张充血，有较多的炎症细胞浸润；3 d时成纤维细胞增生、分化，有明显的血管扩张充血，可见大量的炎症细胞浸润；7 d时成纤维细胞呈环状排列，较多炎症细胞浸润；14 d时成牙本质细胞重新排列，血管基本恢复正常，少许的炎症细胞浸润。

2.2 ICH诱导型HSP70表达结果

A组：各时间点诱导型HSP70表达阴性（－），见封四图1A。

B组：24 h时成牙本质细胞、成纤维细胞呈现淡黄色的弱阳性（+）表达，血管壁平滑肌细胞及内皮细胞可见棕黄色的中度阳性（）表达。3 d时成牙本质细胞、成纤维细胞、血管壁平滑肌细胞及内皮细胞为棕黄色的中度阳性（）表达，见封四图1B。7 d时成牙本质细胞、成纤维细胞、血管壁平滑肌细胞及内皮细胞为淡黄色的弱阳性（+）表达。14 d时成牙本质细胞、成纤维细胞、血管壁平滑肌细胞及内皮细胞呈阴性（－）表达。

C组：24 h时成牙本质细胞、成纤维细胞呈棕黄色的中度（）表达，血管壁平滑肌细胞及内皮细胞可见棕褐色强阳性表达。3 d时成牙本质细胞、成纤维细胞、血管壁平滑肌细胞及内皮细胞均呈现棕褐色强阳性（）表达，见封四图1C。7 d时成牙本质细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞及内皮细胞均表现为棕黄色中度阳性（）表达。14 d时成牙本质细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞及内皮细胞均呈现淡黄色弱阳性（+）表达。

3 讨论

HSP70由2种同源体构成：结构型HSP70（HSC70）和诱导型HSP70（HSP70），正常生长的细胞中本身就含有结构型HSP70，即HSC70，但诱导型HSP70，即HSP70仅热休克后才出现于细胞中[1]。本实验检测的是诱导型HSP70，因此，对照组（A组）牙髓组织细胞中HSP70呈阴性表达。

N.Bhardwaj等[2]研究表明当机体细胞在受到有害刺激时，HSP70表达就会增加，从而提高细胞对刺激原的耐受程度，并且作为分子伴侣，HSP70参与蛋白质的合成与降解，维持酶的动力学特征，以维护细胞正常功能。此外，HSP70还在细胞抗炎、抗氧化及调节细胞凋亡的过程中起关键作用。有学者[3]研究发现，不良刺激会使机体产生各种炎性细胞因子（IL21、IL22等）及氧自由基的含量增加，与此同时，亦伴有HSP70的大量产生来对抗细胞因子及氧自由基对细胞的损害作用，抑制IL21、IL22的生成并加快氧自由基的消除。C.Kitamura等[4]在研究调节牙髓细胞凋亡的JNK通路时发现，HSP70的过表达可对JNK激酶产生明显的抑制作用，从而阻断JNK介导的细胞凋亡。因此，HSP70可作为评价应激伤害反应的重要指标。

在车针备洞（C组）过程中，器械切割牙体硬组织会不可避免地产热刺激牙髓组织细胞，而且切割过程中会出现牙本质小管暴露，牙本质小管液因压力倒流入髓腔[5]，同时，有热量随牙本质小管液传递到牙髓组织内使髓腔内温度升高。这种热刺激不但可以引起炎症反应，而且牙髓组织细胞中HSP70也会大量表达，因此，本实验中可见车针备洞后24 h成本质细胞层排列紊乱，血管扩张充血，并有炎性细胞浸润，HSP70中强度阳性表达。3 d时炎症反应更加明显，HSP70强阳性表达，而后炎症逐渐减弱，HSP70阳性表达下降。14 d时炎症基本消失，HSP70呈弱阳性表达。

在Er：YAG激光备洞组（B组）中，在各时间点牙髓组织炎症表现及HSP70阳性表达都明显低于同时期的车针备洞（C组）。这可能与激光切割牙体硬组织的原理有关。Er：YAG激光照射的能量被水雾和牙体硬组织的水分子吸收后，发生一系列的微爆裂和汽化作用，导致钙化组织表面发生碎裂而达到切割的目的[6]。这与车针备洞的机械切割产热不同，Er：YAG激光切割过程中激光的大部分能量被水吸收转化为动能，产热较少，对深层组织不会造成热损伤[7]，所以 Er：YAG 激光组所受的热刺激要明显小于车针组。

此外，本实验结果表明，随着实验时间的延长，Er：YAG激光备洞组（B组）HSP70表达强度减弱的速度要明显快于车针备洞组（C组）。这可能有2个原因：一是B组的刺激及炎症反应较轻，HSP70阳性表达一直低于C组，在应激反应末期能更快地恢复到正常；二是B组牙髓细胞的修复速度大于C组。

总之，Er：YAG激光备洞对兔牙髓组织的影响明显小于车针备洞，且Er：YAG激光备洞后兔牙髓组织的恢复速度明显快于车针备洞，提示Er：YAG激光用于临床切割牙体硬组织有着很好的前景。

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