杜仲甙治疗被动吸烟导致的骨质疏松的实验研究

刘月耀 ，张魁忠 ，孙贵才 ，徐 聪 ，吴炳华 ，凌 强

（1.宜黄县人民医院骨科,江西 宜黄 344400；2.南昌大学第四附属医院骨科，南昌 330003）

吸烟是一种对健康十分有害的因素，目前有研究已经证实了吸烟不仅可以抑制骨的形成，而且可能直接影响骨量峰值的形成，不同程度的促使骨质疏松症（osteoporosis，OP）的发生，而且周锋波发现不吸烟的OP患病率明显比吸烟者要低[1-2]。早在20世纪90年代，就有学者对杜仲叶的水提取物进行了研究，发现其具有抗骨质疏松功效[3-4]，最近张贤等[5]也发现杜仲可有效防治去卵巢大鼠骨量的丢失。本研究观察杜仲叶提取物中杜仲甙对被动吸烟引起的骨质疏松是否有治疗效果，为骨质疏松症的临床治疗和实验研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

杜仲甙（成都瑞芬思生物科技有限公司），SD大鼠（南昌大学动物实验中心），碱性磷酸酶试剂盒（南京建成试剂公司），抗酒石酸盐酸性磷酸酶（TRAP）试剂盒（大连宝生物公司），双光子骨密度仪（Lunar PIXImus,GE Medical Systems,WI,USA）

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组并干预

30只2个月龄SD大鼠，雌雄各半，体质量（211.52±15.66）g，大鼠按随机数字表法分成3组，空白对照组、被动吸烟组、杜仲甙治疗组，每组10只。1）空白对照组：常规方法饲养，不给予任何处理；2）被动吸烟组：常规方法饲养的同时给予被动吸烟；3）杜仲甙治疗组：常规饲养，被动吸烟制造骨质疏松模型，给予杜仲甙 300 mg·kg-1·d-1灌胃。被动吸烟组和杜仲甙治疗组大鼠按照“密室熏烟”法处理，被动吸烟时移至专供熏烟的实验室（6 m3），关闭门窗，空调通风换气，控制室温20℃；每天上、下午各烟熏1次，每次同时点燃香烟100支，每只大鼠平均吸烟5支，每次被动吸烟1 h。

1.2.2 骨密度测量

所有实验大鼠予戊巴比妥钠麻醉后，进行双光子骨密度测定（Lunar PIXImus，GE Medical Systems,WI,USA）。选择动物研究模式测定。分别测量腰椎骨密度、骨容积以及腰椎测量区域面积。

1.2.3 动物生化学检测

动物处理4个月，对所有大鼠在麻醉条件下进行骨密度（bone mineral density，BMD）检测后，处死大鼠，从实验动物颈动脉取血后，室温下低速（500 r·min-1，离心10 min）离心后，小心吸取上层血清，转移至EP管中，-80℃超低温冰箱保存。获取全部标本后统一送实验室采用标准实验室方法检测血清磷（P）、钙（Ca2+）、碱性磷酸酶（ALP）及酸性磷酸酶（ACP）值。

1.2.4 骨质疏松模型鼠体质量变化

在给予实验干预前、干预结束后分别对大鼠体质量进行测量并记录，观察实验组之间大鼠体质量变化情况。

1.2.5 骨组织形态学测量

麻醉处死大鼠后，剔除大鼠胫骨周围软组织，将近端胫骨置入10%中性福尔马林液中固定3 d，室温下用10%EDTA螯合剂脱钙10 d，随后逐级浓度梯度乙醇脱水，石蜡包埋。在Leica 2500E型切片机上进行骨组织切片，纵形切片，厚度为10 μm，取中心矢状面切片进行H.E染色，显微镜下摄片。用图像分析系统对照片进行骨组织形态学参数测量。骨组织形态学参数指标如下：1）骨容量百分比（BV/TV）：骨小梁容量（BV）占骨组织容量（TV）的百分比；2）骨小梁厚度（Tb.Th）；3）骨小梁数量（Tb.N）；4）骨小梁疏密度 （Tb.Sp）。 其中骨小梁厚度（Tb.Th，μm）为骨容量百分比 （BV/TV）除以1/2骨表面积（BS）。Tb.N及Tb.Sp由以下公式计算：Tb.N=(BV/TV)/Tb.Th，Tb.Sp=1/Tb.N－Tb.Th。 测量放大倍数为×312.5倍。测量区域为距离骨干骺端生长板最低点0.4 mm以下，距离两侧骨皮质表面0.4 mm以内区域。测量长度为骨干骺端生长板最低点以下2 mm范围内骨小梁。

1.3 统计学方法

本研究结果测量的数据用SPSS 13.0统计软件中多因素方差分析的方法进行统计，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 杜仲甙对被动吸烟大鼠体质量的作用

在药物干预治疗前及治疗后，分别对大鼠的体质量变化进行了统计。本研究发现，对照组大鼠在实验后体质量比被动吸烟组大鼠要高出32%。这表明吸烟对大鼠体质量的减轻具有重要作用。然而，被动吸烟组及杜仲甙治疗组大鼠在实验后的体质量相对实验前分别增长 13%[（129.08-114.13）/114.13×100%]和[（148.36-114.25）/114.25×100%]29%，杜仲甙治疗组大鼠体质量较被动吸烟组大鼠体质量高16%，2 组比较差异有统计学意义（P＜0.05）（表 1），说明杜仲甙对吸烟引起的体质量减轻有明显的治疗作用。

表1 各组实验前后大鼠体质量变化的比较 ±s,m/mg

表1 各组实验前后大鼠体质量变化的比较 ±s,m/mg

组别对照组被动吸烟组杜仲甙治疗组n 10 10 10 F P实验前 实验后114.94±14.18 166.78±28.81 114.13±17.68 129.08±25.82 114.25±15.36 148.36±19.92 13.237 1.582 0.638 0.000

2.2 杜仲甙对被动吸烟大鼠骨密度的作用

实验后被动吸烟组大鼠骨密度值 （0.171±0.085）g·cm-2较对照组（0.223±0.033） g·cm-2明显下降，说明被动吸烟能够明显引起大鼠骨质疏松。杜仲甙治疗组大鼠的骨密度值 （0.209±0.029）g·cm-2明显较吸烟组骨密度值（0.171±0.085 ）g·cm-2提高，与吸烟组比较具有统计学差异（P＜0.05），但是与对照组骨密度值比较差异无统计学意义。同时，杜仲甙治疗组大鼠骨容积数值较吸烟组明显增加（P＜0.05）（表2）。

表2 各组骨密度参数的比较 ±s

表2 各组骨密度参数的比较 ±s

组别n 骨密度P/（g·cm-2）骨容积V/（m3·kg-1）骨面积A/cm2对照组被动吸烟组杜仲甙治疗组10 10 10 F P 0.223±0.033 0.171±0.085 0.209±0.029 2.361 0.008 0.486±0.067 0.375±0.042 0.458±0.065 3.128 0.026 2.180±0.082 2.196±0.079 2.188±0.072 11.769 0.835

2.3 杜仲甙对被动吸烟大鼠血生化指标的作用

对照组、被动吸烟组、杜仲甙治疗组血清钙的浓度之间无统计学差异，但是被动吸烟组血清钙浓度平均值较对照组和杜仲甙治疗组更低。被动吸烟组大鼠血清磷（P）和碱性磷酸酶（ALP）水平较对照组 分 别 高 出 52.27%[（2.01-1.32）/1.32×100% ] 和51.78%[（88.29-58.17）/58.17×100%]。 杜仲甙治疗组的碱性磷酸酶水平与对照组和被动吸烟组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；被动吸烟组的血清酸性磷酸酶（ACP）水平较对照组明显增高（P＜0.05），杜仲甙治疗组与对照组的血清酸性磷酸酶水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）（表 3），表明杜仲甙能明显下降酸性磷酸酶活性。杜仲甙治疗组碱性磷酸酶较对照组明显增高，差异有统计学意义，说明杜仲甙能明显增加碱性磷酸酶活性。

表3 各组血液生化检测的比较 ±s

表3 各组血液生化检测的比较 ±s

组别对照组n被动吸烟组杜仲甙治疗组10 10 10 F P Ca2+ρ/（mg·dL-1）2.46±0.13 2.35±0.15 2.41±0.12 18.726 0.000 ρ/（mg·dL-1）1.32±0.30 2.01±0.65 1.19±0.28 3.017 0.032 ALP ρ/（pg·mL-1）ACP ρ/（pg·mL-1）58.17±14.87 13.52±2.62 88.29±21.81 16.03±2.55 143.26±38.51 14.86±2.73 0.847 2.351 0.000 0.028

2.4 杜仲甙对被动吸烟大鼠形态学的作用

如封四图1B所示，吸烟组大鼠骨组织切片显示骨质破坏明显，骨小梁稀疏、变薄。对照组及杜仲甙治疗组则可见骨容量明显更高，杜仲甙治疗组骨质破坏、溶解现象较吸烟组明显少。而且，杜仲甙治疗组组骨容量百分比（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th为骨容量百分比（BV/TV）除以1/2骨表面积（BS）及骨小梁数量（Tb.N= （BV/TV）/Tb.Th）等参数指标值较吸烟术组明显提高（P＜0.05），而骨小梁疏密度（Tb.Sp=1/Tb.N － Tb.Th）指标值是明显下降的（P＜0.05）（封四图1C；表4）。结合骨密度及骨容积数据，提示杜仲甙对被动吸烟引起大鼠骨质疏松的骨丢失具有直接保护作用。

表4 杜仲甙对骨质疏松治疗的形态学参数 ±s

表4 杜仲甙对骨质疏松治疗的形态学参数 ±s

组别n 骨小梁数量/（个·μm-2）对照组被动吸烟组杜钟甙治疗组10 10 10 F P骨容量百分比/%38.69±3.11 24.83±3.56 32.28±1.69 15.718 0.000骨小梁厚度d/μm 85.56±1.59 76.05±6.36 80.92±1.97 3.652 0.087骨小梁疏密度0.47±0.04152.08±23.55 0.36±0.39223.57±35.97 0.41±0.25168.37±14.62 9.667 12.565 0.000 0.000

3 讨论

3.1 被动吸烟和主动吸烟均能够明显导致骨质疏松

A.Bush等[6]发现吸烟组BMD比非吸烟组低，大量吸烟组中BMD、骨强度指标与非吸烟组相比差异更为显著。最近研究[7]证明吸烟组腰椎正位总体、髋部总体、股骨颈与Ward’s区BMD显著低于非吸烟组。吸烟组股骨远端体积/总体积比及骨小梁厚度均显著低于对照组[8]。A.Afghan 等[9]研究证实了被动吸烟女性骨质疏松患病率是不吸烟家庭3倍，同时她们中脆性骨折史也是后者的2.6倍。王溪原等[10]研究也发现被动吸烟绝经女性股骨大部分骨密度指标和抗骨折能力数据明显低于不吸烟组；认为不管是主动吸烟行为，还是被动吸烟行为对绝经女性骨密度和骨强度指标损害是类似的。被动吸烟者暴露在烟雾中仅仅30 min，他们血液流变学功能指标改变就与经常主动吸烟者区别不明显，至少在短期内是这样。这些证据直接说明了被动吸烟同样能够对不吸烟者身体的各个系统造成有害影响[11]。所以本实验选择了被动吸烟的形式制造骨质疏松模型，本方法简便易行而且有效。本研究发现，被动吸烟组大鼠的体质量在研究前3组无差异，在研究后3组的体质量明显有差异，而且被动吸烟组比对照组和杜仲甙治疗组明显减轻，说明吸烟明显能影响大鼠体质量的正常增加，同时也说明被动吸烟可以引起全身各个系统的损害。

骨组织是由有机基质和无机矿物质构成，基质由成骨细胞分泌，经矿化后为骨骼提供支架，骨基质协调成骨细胞及破骨细胞的代谢从而储存离子和生长因子；矿物质由钙羟基磷灰石晶体和钙磷混合物构成。骨矿化过程中，钙离子由组织细胞提供或由经消化系统吸收入血循环的钙提供，其中50%与血浆蛋白相结合，从而保持游离钙离子浓度低于溶液中形成磷酸盐水平。磷离子来源于代谢物质焦磷酸的裂解,然后再与磷脂或磷脂蛋白相结合,构成循环中的磷离子。ALP是成骨细胞的一种外酶，在成骨过程中ALP水解膦酸酯，为羟基磷灰石的沉积提供必需的磷酸，进基质矿化。血浆抗酒石酸盐酸性磷酸酶（sTRACP）是由多核破骨细胞（OC）释放，具有很高吸收功能活性，是破骨细胞功能的重要标志。血液中TRAP主要来源于骨吸收过程中破骨细胞的释放，TRAP的活性与骨吸收状况相平行,不受膳食、运动和年龄的影响。

为了证明被动吸烟是否能够引起骨质疏松，本研究检测了被动吸烟组与对照组之间骨密度、血清钙、血清碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、形态学改变等指标。无论从间接形态学参数（表2、表4）还是直接形态学（图1）检测均发现吸烟组中平均骨密度较对照组显著下降；血清中钙浓度较对照组明显下降、酸性磷酸酶浓度较对照组显著升高（表3），说明被动吸烟组中骨吸收较骨形成更强，打破了骨的代谢平衡，从而形成了骨密度下降。

3.2 杜仲甙明显改善被动吸烟引起的骨质疏松

目前临床上治疗OP的药物基本以双磷酸盐、钙制剂等为主，长期服用可产生依赖性和不良反应[12]。治疗OP的药物大多数是骨吸收的抑制剂，少数药物能促进骨形成，具有双重功效的药物缺乏。药理研究[13]表明，杜仲提取物对成骨细胞有增殖作用，对破骨细胞有抑制作用。杜仲可增加去卵巢大鼠体内E2含量，降低体内骨钙素（BGP）及尿羟脯氨酸（HOP）含量，增强去卵巢大鼠腰椎骨密度及提高胫骨抗弯曲力[5]。本研究表明杜仲甙治疗组中骨骨密度与被动吸烟组比较有显著性差异（表2）；从形态学分析，与被动吸烟组比较能够明显增加骨小梁厚度、骨小梁数量、骨容量百分比，减少骨小梁疏密度（图1，表4）；从生化水平分析，与被动吸烟组比较，杜仲甙治疗组能够明显增加碱性磷酸酶浓度，减少酸性磷酸酶浓度（表3）。血清AKP是通过分解磷酸酶，增加局部无机磷的浓度，从而促进骨基质的钙化。而杜仲甙治疗后，血清AKP含量最高，结果提示杜仲甙能显著地提高成骨细胞活性，使骨形成活动增强；同时杜仲甙能明显抑制减少酸性磷酸酶浓度，从而抑制骨的吸收作用。这些数据表明杜仲甙既能促进成骨，又能减少骨吸收，从而明显改善吸烟引起的骨质疏松。

《神农本草经》记载杜仲药效为“补中，益精气，坚筋骨……久服轻身耐老”。杜仲主要功能为补肾、强筋健骨，中医药治疗通过补肾治疗骨质疏松的临床研究已经取得了较好的临床疗效，逐渐受到人们的重视。唐宝平[14]认为全杜仲胶囊治疗骨质疏松疗效显著，值得临床推广。本研究从基础研究发现杜仲甙在生化水平能促进碱性磷酸酶浓度增加，降低酸性磷酸酶浓度；从形态学研究明显改善骨质疏松骨的密度，从而能够治疗吸烟引起的骨质疏松，为杜仲治疗骨质疏松提供了实验依据，同时也为杜仲治疗骨质疏松提供了基础理论依据。

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