脾虚发热证大鼠模型的研究

刘进娜，谢 鸣△，高秀兰，赵荣华

(1．北京中医药大学国家重点方剂学学科，北京 100029;2．山东省中医药高等专科学校，山东 烟台 264100)

脾虚发热证大鼠模型的研究

刘进娜1，谢 鸣1△，高秀兰2，赵荣华1

(1．北京中医药大学国家重点方剂学学科，北京 100029;2．山东省中医药高等专科学校，山东 烟台 264100)

目的:复制并评价脾虚发热大鼠模型。方法:大鼠随机分为正常对照组、单纯脾虚组、脾虚发热组。大鼠采用饮食失节+过度疲劳法复制脾虚模型，于造模第22天腹腔注射LPS(80μg/kg)诱导发热，测定各时间点的肛温、体重、外观行为变化积分值、尿D-木糖排泄率和外周血相关指标。结果:①与正常对照组比较，脾虚发热组大鼠体温除在30min有一过性降低外，其余各观察点均呈显著性升高(P＜0．01，P＜0．05);单纯脾虚组大鼠体温除在60min时有一过性升高外，其余各点无显著性差异;脾虚发热组与单纯脾虚组大鼠在第1、2、3周末的体重均明显降低;第2、3周末的外观行为变化总积分值呈显著性增加(P＜0．05，P＜0.01);第 3 周末的尿 D-木糖排泄率、血 GAS、MTL、IL-1β、IL-2、T3、T4、TSH 均降低，IL-6 和 SS 升高(P ＜0．05，P ＜0．01);②与单纯脾虚组相比，脾虚发热组大鼠体温在30min时有一过性降低，之后体温一直呈显著性升高(P＜0．01);外周血T4含量显著性降低(P＜0．01)，其余各指标的差异无显著性。结论:饮食失节+过度疲劳+LPS注射可引起大鼠出现类中医脾虚发热证。

脾虚;脾虚发热;证候模型

脾虚发热是中医脾虚证中的一个特别类型，以脾虚同时伴有发热见症为特点。基于中医证候模型复制的基本要求和中医病因及发病学理论，本研究拟在以往工作基础上，参考脾虚发热的“气虚邪郁”机理，采用“饮食劳倦+过度疲劳法 +LPS注射”方法复制脾虚发热大鼠模型。本文报告了该模型的复制及其评价。

1 材料

1．1 动物

雄性Wistar鼠200g～220g，购于北京市维通利华实验动物技术有限公司(动物许可证号 SCXK(京)2006～0009)。

1．2 试剂

LPS注射液的制备:脂多糖(Escherichia coli endotoxin 055B5，L2880，LPS)，Sigma 公司生产。无菌条件下，用生理盐水将 LPS配成浓度为20μg/ml的LPS注射液，备用。D-木糖:Sigma公司生产(生产批号 C5H10O5)。GAS、IL-1β、IL-2、IL-6、T3、T4、TSH、MTL、SS试剂盒由北京华英生物技术研究所提供(生产批号20101106)。

1．3 仪器

电脑数字温度计MC-3B型:OMROM欧姆龙(大连)有限公司生产;塑料钢化筒:执行标准:Q/WHC02-2002;r-911全自动放免计数仪:中国科技大学实业总公司生产。

2 方法

2．1 制模方法

采用饮食失节+过度疲劳复制脾虚+LPS腹腔注射诱导发热［1］的复合方法。实验前全部动物进行预游泳筛选，剔除游泳时间少于 10min、大于20min的大鼠。符合上述条件的大鼠每天 PM 2∶00置于盛有温水 22℃ ±1℃的塑料钢化桶中游泳10min，每次3只，有抱团现象即刻轻轻使之分开;隔日喂食(隔日禁食，隔日足量给食)，连续3周复制脾虚模型。于实验第22天AM 8∶00给予大鼠一次性腹腔注射LPS(80μg/kg)诱导脾虚发热。

2．2 分组处理

大鼠随机分为正常对照组、单纯脾虚组、脾虚发热组共3组，每组10只。单纯脾虚组和脾虚发热组大鼠按上述脾虚证制模方法，连续3周。正常对照组给予等量生理盐水。于造模第22天的上午8∶00，脾虚发热组大鼠腹腔一次性注射 LPS(80μg/kg)诱发动物发热，单纯脾虚和正常对照组大鼠注射等量生理盐水。

2．3 指标测定

实验期间，每周测量体重和体温各1次，并观察记录其外观行为变化，统计各组变化分值。第21天各组大鼠灌服10%D-木糖溶液5ml，于代谢笼中收集大鼠5h的尿液，用简苯三酚法测定 D-木糖排泄率(即尿液中排出的剂量与所灌入胃内总剂量的比率)。于造模第22天测定各组大鼠腹腔注射后30min、60min、120min、180min、240min、330min 的肛温，绘制各组平均体温曲线。随后即刻腹腔注射10%水合氯醛(0．35ml/100g体重)麻醉，腹主动脉取血6ml，其中 3ml室温放置，2500rpm 15min取血清;3mL于管中预置的10%EDTA·Na230μl和抑肽酶40μl充分混匀，2000rpm 10min取血浆，血清和血浆于冰箱-20℃保存。放免试剂盒法测定 GAS、IL-1β、IL-2、IL-6、T3、T4、TSH 和 MTL、SS。

2．4 统计方法

3 结果

3．1 各组大鼠的体温变化

表1图1显示，与正常对照组比较，脾虚发热组大鼠体温在30min时有一过性降低，之后体温显著升高，其中在 60min、120min、180min、240min 时的差异均有显著性(P ＜0．01，P ＜0．05);单纯脾虚组大鼠的体温在60min时有一过性升高，差异有非常显著性(P＜0．01)，之后体温变化不大，各点体温差异均无显著性(P＞0.05)。与单纯脾虚组相比，脾虚发热组大鼠体温在30min时有一过性降低，之后体温明显升高，其中120min、180min、240min时的差异均有显著性(P ＜0．01)。

图1显示，除正常对照组大鼠于注射后30min时有一过性小幅升高外，其余时间点的体温变化不大。与正常对照组相比，单纯脾虚组大鼠体温在60min时有一过性升高并出现峰值，之后下降并趋于平稳，其60min～180min时段的体温曲线下移;脾虚发热组体温在30min时一过性下降，之后体温逐渐升高，180min时出现峰值，之后有所下降，60min～330min时段的体温曲线上抬。与单纯脾虚组相比，脾虚发热组大鼠体温 60min时升高，60min～180min的体温曲线明显上抬。

表1 各组大鼠不同时间点的△T变化(±s，n=10)

表1 各组大鼠不同时间点的△T变化(±s，n=10)

注:正常对照组比较:*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01;与单纯脾虚组比较:▲▲ P ＜0．01

组 别 例数不同时间点的△T/min 30 60 120 180 240 330正常对照组 10 0．24 ±0．50 －0．07 ±0．39 0．07 ±0．41 0．19 ±0．390．03 ±0．35 0．00 ± 0．46单纯脾虚组 10 －0．08±0．67 0．37±0．20＊＊ －0．19 ±0．27 －0．15±0．34 －0．40±0．45 －0．20±0．44脾虚发热组 10 －0．46 ±0．60* 0．56 ±0．24＊＊ 0．38 ±0．47＊▲▲ 1．36 ±0．61＊＊▲▲ 0．49 ±0．27＊＊▲▲0．11 ± 0．37

图1 各组大鼠不同时间点的△T变化曲线

3．2 各组大鼠体重和外观表征的变化

3．2．1 体重变化 表2显示，正常对照组大鼠体重随时间不断明显增加，脾虚发热组与单纯脾虚组大鼠体重增加较为缓慢，在第3周末均未见增加。与正常对照组比较，脾虚发热组与单纯脾虚组大鼠在第1、2、3周末的体重均明显降低，差异均有显著性(P＜0．05，P＜0.01)。与单纯脾虚组相比，脾虚发热组大鼠各点的体重无明显变化，差异均无显著性(P ＞0．05)。

3．2．2 行为学变化 表3显示，造模1周后各组大鼠外观行为均未有明显变化，各组总积分差异均无显著性(P＞0．05)。较之正常对照组，实验第2周单纯脾虚组和脾虚发热组大鼠开始表现出活动减少、喜扎堆、饮食减少、皮毛不顺、大便溏薄等;第3周出现动作迟缓、神情怠、毛发不泽、倦卧等变化，其外观行为变化总积分均见明显升高，差异均有显著性(P＜0．01);单纯脾虚组和脾虚发热组大鼠外观行为变化总积分的差异均无显著性(P＞0．05)。

表2 各组大鼠体重变化(±s，n=10)

表2 各组大鼠体重变化(±s，n=10)

注:与正常对照组比较:*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01

组 别 例数造模不同时间点的体重(g)0周 1周 2周 3周正常对照组 10 190．96 ±6．87 237．62 ±10．80 288．71 ±12．93 318．04 ±17．16单纯脾虚组 10 193．01±7．60 220．07 ± 8．39* 231．30 ± 5．41＊＊ 231．29± 7．96＊＊脾虚发热组 10 195．29±7．08 220．97 ± 8．38* 227．30 ± 5．42＊＊ 228．23± 6．49＊＊

表3 各组大鼠不同时间点外观行为总积分(±s，n=10)

表3 各组大鼠不同时间点外观行为总积分(±s，n=10)

注:与正常对照组比较:＊＊P ＜0．01

组 别 外观行为变化总积分第1周末 第2周末 第3周末正常对照组0．18 ± 0．07 0．20 ±0．13 0．21 ±0．15单纯脾虚组 0．33 ±0．25 1．15 ±0．50＊＊ 1．45 ±0．65＊＊脾虚发热组 0．31 ±0．20 1．10 ±0．45＊＊ 1．35 ±0．39＊＊

3．3 各组大鼠与脾虚相关指标的变化

3．3．1 尿 D-木糖排泄率的变化 表4显示，与正常对照组相比，单纯脾虚组和脾虚发热组大鼠尿D-木糖排泄率均降低，差异有显著性(P＜0．05，P＜0．01)。与单纯脾虚组相比，脾虚发热组大鼠尿D-木糖排泄率无明显变化(P＞0.05)。

3．3．2 血中胃肠激素含量的变化 表5显示，与正常对照组相比，单纯脾虚组和脾虚发热组大鼠外周血GAS、MTL含量均明显降低，SS含量升高，差异均有显著性(P＜0．01，P＜0.05)。与单纯脾虚组相比，脾虚发热组大鼠外周血 GAS、MTL和SS含量均无明显变化(P＞0.05)。

3．3．3 血中代谢调节激素的变化 表6显示，与正常对照组相比，单纯脾虚组和脾虚发热组大鼠外周血T3、T4、TSH含量均见降低，差异均有显著性(P＜0．01)。与单纯脾虚组相比，脾虚发热组大鼠外周血T3、TSH含量无明显差异(P＞0.05)，但 T4含量降低，差异有显著性(P＜0．01)。

3．3．4 血中免疫因子的变化 表7显示，与正常对照组相比，单纯脾虚组和脾虚发热组大鼠外周血IL-1β、IL-2含量降低，血 IL-6含量升高，差异均有显著性(P＜0.05，P＜0．01)。与单纯脾虚组相比，脾虚发热组大鼠外周血 IL-1β、IL-2和IL-6含量均无明显差异(P＞0.05)。

表4 各组大鼠尿D－木糖排泄率的变化(±s)

表4 各组大鼠尿D－木糖排泄率的变化(±s)

注:与正常对照组比较:*P ＜0.05，＊＊P ＜0．01

组 别 例数 D 木糖排泄率正常对照组10 23．84 ± 0．50单纯脾虚组 10 19．65 ±4．18＊＊脾虚发热组 10 20．22 ±5．42*

4 讨论

脾虚发热是中医脾虚证中的一个特别证型，有关该模型复制的研究比较少。之前，张丽萍等［2、3］采用饥饿法(动物禁食7d)造成兔气虚模型，再给予耳缘静脉注射伤寒、副伤寒三联疫苗0．5ml/kg诱导气虚发热模型，并观察到补中益气汤不同剂量及其拆方对该模型均有不同的退热作用。刘瑜彬等［4］以大鼠ΔT和体重为观察指标，采用游泳劳损 +食量限制+注射LPS复制大鼠气虚发热模型，并观察了补中益气汤高、中、低剂量对模型体温的影响。这两篇报道均以发热为重点，对模型涉及脾虚的特性仅限于动物一般外观行为上的描述，缺乏实验室相关指标的支持，作为脾虚或气虚发热的模型仍有待评价。

表5 各组大鼠外周血中胃肠激素的变化(±s)

表5 各组大鼠外周血中胃肠激素的变化(±s)

注:与正常对照组比较:*P ＜0.05，＊＊P ＜0．01

组 别 例数 外周血中的胃肠激素含量GAS(pg/ml) MTL(pg/ml) SS(pg/ml)正常对照组9 69．57 ±13．78 438．17 ±52．26 231．72 ± 9．95单纯脾虚组 9 55．84 ± 7．85＊＊ 384．44 ±23．41* 265．34 ±37．61*脾虚发热组 9 55．44 ± 6．91＊＊ 359．27 ±33．00＊＊ 260．23 ±41．11*

表6 各组大鼠外周血相关物质代谢指标的变化

表7 各组大鼠外周血中免疫因子的变化(±s)

表7 各组大鼠外周血中免疫因子的变化(±s)

注:与正常对照组比较:*P ＜0.05，＊＊P ＜0．01

组 别 例数 外周血中的相关介质IL-1β(pg/ml) IL-2(pg/ml) IL-6(pg/ml)正常对照组9 0．69 ± 0．05 7．43 ± 1．83 153．05 ± 41．57单纯脾虚组 9 0．23 ±0．02* 5．60 ±1．65* 200．96 ±62．95*脾虚发热组 9 0．29 ±0．02* 5．40 ±0．82＊＊ 228．64 ±28．60＊＊

之前本学科曾根据中医“饥饱失常、肠胃乃伤”和“劳则伤脾”的中医发病学理论，采用饮食失节+过度疲劳法，成功复制出脾虚证大鼠模型［5］。在探讨小柴胡汤及其不同配伍与效用关系的研究中，曾应用小剂量LPS腹腔注射成功诱导出大鼠发热模型［6、7］。本次则根据中医脾虚发热证的脾虚 +发热的临床特征，结合有关脾虚发热机制认识中的“气虚邪郁”［8］以及 LPS作为外源性致热源的特性，提出“饮食失节 +过度疲劳 +外邪复感”的脾虚发热机制，采用“间隔断食+游泳疲劳 +腹注 LPS”的方法来复制脾虚发热模型。

目前中医脾虚证模型复制的方法较多，但有关模型的评价学界尚未有公认统一的评判标准。通常，如能同时满足在模型复制思路或方法上尽可能符合中医病因及发病学经验、模型动物比较好地表现出类似中医临床症状、出现与中医证密切相关的现代生理病理改变(相关实验室指标)这样一些条件应该是可以得到多数人认同的。基于这种考虑，本模型复制研究中设立了包括体重变化在内的外观表征、与脾虚相关的实验室指标及发热等多组指标群以能全面评估模型的系统特征。其中对与中医症征密切相关的动物外观行为的观察，在以往定性描述的基础上，引入各行为分值及表征变化总积分值的半定量方法来提高判断的客观准确性。实验室指标的选定则是根据中医脾主运化、为气血生化之源及气主卫外功能，参考了目前有关脾虚现代研究的部分成果，如与脾虚相关的胃肠功能(血GAS、MTL和 SS 及尿 D-木糖排泄率)［9、10］、物质代谢(血 T3、T4、TSH)［11、12］及 免 疫 功 能 (血 IL-1β、IL-2、IL-6)［13、14］等多组指标以作为该模型评定的佐证。

本实验观察到，单纯脾虚组和脾虚发热组大鼠于实验第2周开始表现出活动减少、喜扎堆、饮少便溏、皮毛不顺泽等外观变化，实验第3周进一步出现明显的动作迟缓、倦怠倦卧、毛发不泽等表现，外观行为变化积分值和体重分别出现明显的升高和降低。同时反映胃肠功能的血GAS、MTL和尿D-木糖排泄率明显降低;反映机体代谢水平的血 T3、T4及TSH含量以及反映免疫(防御)功能状态的血 IL-1β、IL-2含量均见降低，与之前的研究结果［6］相一致。结果再次表明，采用饮食不节加游泳疲劳的方法可以稳定诱导出大鼠的中医脾虚证。实验还观察到，单纯脾虚模组大鼠按80μg/kg剂量一次性腹腔注射LPS 30min后出现体温升高，持续升高的体温超过6h。综合大鼠外观行为、脾虚相关实验室指标及发热等多组指标的变化，可以判断该模型大鼠的确具有中医脾虚发热证的特征。结论为采用饮食不节+游泳疲劳与注射LPS方法可诱导出大鼠脾虚发热证模型。

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Research on the rat model of fever due to spleen deficiency syndrome

LIU Jin-na1，XIE Ming1△，GAO Xiu-lan2，ZHAO Rong-hua1
(1．Formulary Department，the national key discipline，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing100029，China;2．Shandong College of Traditional Chinese Medicine，Yantai246100，China)

Objective:To copy and value the model of spleen-qi deficiency with fever．Methods:The rats were assigned into the normal group，spleen-deficiency group，spleen-deficiency with fever group．The rats were treated with excess fatigueout of constant diet to copy spleen-qi deficiency rat model．On the 22th day，The rats of spleen-qi deficiency with fever group were respectivelyipwith LPS(80μg/kg)to induce fever．The rectal temperature was measured．The body weight and change of syndrome and autonomous behavior was observed．D-xylose of urine and peripheral blood GAS，MTL，SS，IL-1β，IL-2，IL-6，T3，T4，TSH are measured．Result:①Compared with the normal group，the rectal temperature of spleen-qi deficiency with fever group has a transient decrease at 30min，then raised obviously(P＜ 0．05，P＜0．01);the spleen-qi deficiency group has a transient decrease at 60min，then return to the basic line．The body weight of spleen-qi deficiency and spleen-qi deficiency with fever group were decreased obviously at the end of 3w(P＜0．01)and the integral quantity of appearance behavior change were significantly increased at the weekend of 2w and 3w(P＜0．05，P＜0．01);Urine D-xylose excretion rate，peripheral blood GAS，MTL，IL-1β，IL-2，T3，T4，TSH decreased and IL-6，SS increased(P＜ 0．05，P＜0．01)．②Compared with the spleen-qi deficiency group，temperature of spleen-qi deficiency with fever group has a transient decrease at 30min，then raised obviously(P＜0．01)．Blood T4has decreased obviously(P＜0．01)，other indexes have no significance．Conclusion:By adopting excess fatigue+out of constant diet+LPS injection had induced the rats show a serial of appearance in syndrome model of autonomous behavior，body weight，body temperature which were similar to Chinese symptoms of spleen-qi deficiency with fever．

Spleen-qi deficiency;Spleen-qi deficiency with fever;Syndrome model

R332

B

1006-3250(2012)02-0150-04

刘进娜(1983-)，女，河北邢台人，医学硕士，从事方-证相关的研究。

△通讯作者:谢 鸣(1957-)，男，安徽安庆人，教授，博士研究生导师，医学博士，从事方-证相关研究，Tel:01064286992，E-mail:xieming603@263．net。

2011-09-08