解毒化瘀法灌肠对溃疡性结肠炎慢性期P-selectin指标的影响

刘 亚，林 燕，李兴广

(北京中医药大学，北京 100029)

溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis，UC)的病理特点是结肠黏膜及黏膜下层形成慢性炎症和溃疡，反复发作、迁延难愈是其病理特点，是国内外医学界研究的重点。本课题采用缓解期解毒化瘀中药持续灌肠治疗在抗复发方面取得较好疗效，通过动态观测大鼠结肠黏膜P-selectin水平变化，探讨解毒化瘀方的抗复发机理。

1 方法

1.1 材料

动物:清洁级健康 Wistar大鼠，雌雄各半，体重160g～200g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供(动物合格证号 SCXK(京)2006-0009);清洁级健康新西兰家兔，体重约2000g，由北京海淀兴旺实验动物养殖场提供(动物合格证号0003738)。试剂:三硝基苯磺酸(TNBS)(Sigma公司)、弗氏完全佐剂 (Sigma公司)、P-selectin antibody(abcam)、20%福尔马林、10%水合氯醛。药物:解毒化瘀方(黄连、黄芩、苦参、三七粉等)(北京同仁堂药店);奥沙拉嗪(中日友好医院)。

1.2 方法

1.2.1 造模 采用家兔结肠黏膜-TNBS/乙醇液的免疫化学法造模。

1.2.2 分组设计与给药 分两个阶段。将260只大鼠随机分为4组，正常组50只，模型组50只，中药组(解毒化瘀方)80只，西药组80只。第一阶段为急性期第1～2周(相当于UC发作期)。中药组给予解毒化瘀方灌肠给药，西药组给予奥沙拉嗪灌肠给药，正常组、模型组用洁净水灌胃。第二阶段为慢性期第3～4周(相当于 UC缓解期)。将上述急性期的中药灌肠组随机分为中药持续灌肠组和中药停药组2组，中药灌肠组继续解毒化瘀方灌肠治疗，中药停药组停止中药灌肠;同样，将上述急性期的西药灌肠组也随机分为西药持续灌肠组和西药停药组2组，西药灌肠组继续奥沙拉嗪灌肠治疗，西药停药组停止西药灌肠。正常组、模型组、中药停药组、西药停药组均用洁净水灌胃。

1.2.3 取材与处理 于造模后第1天在造模组中随机选择10只取材，再分别于给药后1周末、2周末、3周末和4周末每组随机取10只大鼠杀检取材，进行相关指标检测。以10%水合氯醛腹腔麻醉后剖检，腹主动脉采血。然后截取自肛门以上8cm～12cm处病变结肠约1cm。将采集标本投入20%福尔马林液中常温保存72 h，将标本脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、6μm厚切片。

1.3 检测指标 P-selectin免疫组化操作步骤:①脱蜡，水化组织切片;②3%H2O2去离子水孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶;③PBS冲洗，3 min×3次;④滴加一抗(P选择素稀释50倍)，4℃过夜;⑤PBS冲洗3 min×3次;⑥滴加试剂1，室温孵育20 min，PBS冲洗3 min×3次;⑦滴加试剂2，室温孵育20 min，PBS冲洗3 min×3次;⑧DAB溶液显色(稀释20倍);⑨去离子水冲洗、复染、脱水、透明和封片。NIKON显微照相系统观察病理改变，显示各组组织学结构或病变特征。

2 结果

2.1 UC急慢性不同时期病理机制的异同

2.1.1 不同时间非给药 UC大鼠 P-selectin Mean Density表达的变化 表1显示，不同时间非给药组UC大鼠与正常组大鼠P选择素表达有显著性差异(P＜0.05);随时间推移，UC大鼠 P选择素阳性表达依次减小，且有显著性差异，但仍明显高于正常组大鼠(P＜0.05)。

表1 不同时间非给药UC大鼠P-selectin Mean Density的变化

2.2 中西药灌肠对 P-selectin Mean Density表达的影响

2.2.1 比较慢性期中、西药对 P-selectin Mean Density表达的调控 表2显示，在慢性期，中西灌肠组大鼠与正常组大鼠相比P-selectin表达较高，且有极显著差异，而在第4周末中药灌肠组与正常组更接近;慢性期中、西药灌肠组与模型组相比 P-selectin表达较低，且有极显著差异;同时期中药灌肠组与西药灌肠组相比P-selectin表达较低，且有极显著差异;中药灌肠组第4周末与第3周末相比P-selectin表达较低，有极显著差异;西药灌肠组第4周末与第3周末相比P-selectin表达较低，有极显著差异。

表2 比较慢性期中、西药灌肠组P-selectin Mean Density的表达

2.3 比较缓解期中西药持续灌肠与停药的疗效差异

2.3.1 比较缓解期中药灌肠与中药停药的疗效 表3显示，在慢性期第4周末中药灌肠组与正常组最接近，但仍有显著差异;其他组大鼠与正常组相比，P-selectin表达较高，且有极显著差异;慢性期中药灌肠组和停药组大鼠与模型组大鼠相比，P-selectin表达较低，且有极显著差异;慢性期中药灌肠组与中药停药组相比P-selectin表达较低，且有极显著差异;中药灌肠组第4周末与第3周末相比表达降低，有极显著差异;中药停药组第4周末与第3周末相比表达降低，有显著差异。

表3 缓解期中药灌肠组与中药停药组P-selectin Mean Density表达的异同

2.3.2 比较缓解期西药灌肠与西药停药的疗效 表4显示，在慢性期西药灌肠组和停药组大鼠与正常组相比，P-selectin表达较高，且有极显著差异;西药灌肠组和停药组大鼠与模型组大鼠相比，P-selectin表达较低，且有极显著差异;慢性期西药灌肠组与西药停药组相比，P-selectin表达较低，且有极显著差异;西药灌肠组第4周末与第3周末相比，表达降低，有极显著差异;西药停药组第4周末与第3周末相比表达降低，有显著差异。

3 结论

资料表明，P-selectin属黏附分子选择素家族的组分之一，由活化血小板、内皮细胞分泌表达，并可作为这些细胞活化的标志，介导中性粒细胞和单核细胞对活化血小板和内皮细胞的黏附，是活化血小板最特异和敏感的分子标志物［1］。研究证实，UC患者血浆中 P选择素的含量明显高于健康人，虽然缓解期患者其含量有所下降，但仍然明显高于正常组［2］。它在 UC发病机制中可能的作用是:①活化的血小板通过局部释放炎症介质、化学趋化物(如PF4、PAF)及激活其他炎症细胞参与和增强肠黏膜炎症过程;②血小板活化及其衍生的 TXA2易使血小板聚集阻塞肠黏膜微循环，加重肠黏膜缺氧、损伤;③血小板衍生因子从活化的血小板释放出来，在组织损伤后的修复中起重要作用［3］。

表4 缓解期西药灌肠组与西药停药组P-selectin Mean Density表达的异同

3.1 初步明确溃疡性结肠炎发作期与缓解期的病理机制

微循环障碍贯穿UC的始终，急性期微循环障碍严重，慢性期微循环障碍持续存在，这种病理现象对肠黏膜屏障的修复有不利影响，可能是引起UC复发的病理机制。

3.2 阐明慢性期中西药灌肠治疗溃疡性结肠炎各自疗效优势及保护机制

在UC慢性期，中西药持续给药均可改善肠黏膜的微循环状态，改善 UC模型大鼠的一般状况。但这时中药组的疗效更为显著。在慢性期末，中药灌肠组的P-selectin指标最接近正常值，可以认为在缓解期改善微循环方面中药较西药更有优势。

3.3 证实缓解期中药持续灌肠治疗能够更加有效地抗UC复发

慢性期，中西药给药组和停药组均可见UC大鼠P-selectin Mean Density表达下降、一般状况持续好转和炎性反应继续减少。不同的是，给药组的总体情况较停药组改善更迅速，其中中药给药组的P-selectin Mean Density最接近正常组，而西药给药组次之。由此可见，与缓解期(慢性期)停药相比，在缓解期中药持续给药对改善UC肠黏膜微循环装填更具优势。

综上所述，微循环障碍贯穿UC的始终，急性期微循环障碍严重，慢性期微循环障碍持续存在，这可能正是UC复发的关键病理机制。在缓解期，中药与西药相比能更加显著地改善微循环状态;在缓解期末，中药持续给药的疗效已接近正常，可见缓解期中药持续灌肠治疗能够更加有效地抗UC复发。

［1］赵亚鹏，金佩佩，周同，等.P-选择素及其细胞黏附与血栓形成［J］.细胞生物学杂志，2007，29:22-26.

［2］杨权，陈守国，许宁.溃疡性结肠炎患者血浆P选择素的测定及其意义［J］.海南医学，2004，10.8(5):322-325.

［3］Papalambros E，Sigala F，Travlou A，et al.P -selectin and antibodies against heparin-platelet factor 4 in patients w ith venous or arterial dis 2 eases after a 7-day heparin treatment［J］.J Am C oll Surg，2004 ，199(1):69-77.