芪黄明目胶囊对糖尿病小鼠视网膜氧化应激作用及机制研究

张会欣，王宏涛，赵韶华，朱慧明，崔庆飞，齐晓琳

(1.河北以岭医药研究院药理室，石家庄 050035;2.石家庄以岭药业股份有限公司，石家庄 050035)

糖尿病视网膜病(DR)发病原因错综复杂，其具体机制仍不清楚，亦无疗效理想的品种出现。大量研究表明，高糖引起的氧化应激可能是造成视网膜损伤的主要原因之一［1］。芪黄明目胶囊在治疗DR临床II期实验中显示了很好的效果［2］，我们以自发性2型糖尿病KK/Upj-Ay小鼠为模型，从氧化应激角度研究芪黄明目对DR的保护作用及其对丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的调控作用，探讨芪黄明目的抗氧化作用及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 KK/Upj-Ay小鼠40只，30g～40g;C57BL/6雄性小鼠 10只，25g～30g，均为 SPF级，12周龄(购于北京华阜康生物科技股份有限公司，动物合格证号0225144)。

1.1.2 试剂与仪器 芪黄明目胶囊，由石家庄以岭药业股份有限公司提供;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)、过氧化氢酶(CAT)试剂盒购自南京建成生物研究所;p38丝裂原活化激酶(p38MAPK)、磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、磷酸化JNK(p-JNK)、细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)、磷酸化 ERK(p-ERK)一抗购自美国Cell Signaling Technology公司。凝胶成像分析仪，Biorad。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组与给药 40只KK/Upj-Ay小鼠按空腹血糖值(FBG)分为模型组、芪黄明目高、中、低剂量组，另设C57BL/6小鼠为对照组，每组10只动物。采用灌胃给药，芪黄明目高、中、低剂量组分别给予8.32、4.16、2.08 g生药/kg的芪黄明目胶囊，对照组和模型组给予等体积的蒸馏水，每日1次，连续3个月。

1.2.2 一般观察 给药期间观察小鼠全身一般情况，每周1次测定体重、摄食、摄水、尿量，每月测定1次 FBG。

1.2.3 氧化指标的测定 取血并按说明书比色法测定SOD、GSH-Px活性和 CAT、MDA含量。

1.2.4 形态学变化 取小鼠眼球置于甲醛固定，HE染色;小鼠眼球置于戊二醛固定，电镜观察超微结构。

1.2.5 Western blot法 检测 p38MAPK、pp38MAPK、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK 蛋白的表达。取视网膜组织常规方法提取蛋白质，化学发光法显色，对条带进行吸光度积分扫描。GAPDH作为内参照。用目的蛋白吸光度值/内参照吸光度值的比值进行比较。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 一般情况

表1显示，模型组小鼠明显体重减轻，多饮、多食、多尿明显，芪黄明目能明显缓解“三多一少”症状，对照组饮食正常，体重增长明显，无上述症状出现。模型组FBG明显高于对照组，芪黄明目组空腹血糖明显低于模型组，治疗8周后中、高剂组即有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。

表1芪黄明目对DR小鼠FBG的影响(±s，n=10)

注:与模型组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与对照组比较:△P＜0.05，△△P＜0.01

组别FBG药前 第4周 第8周 第12周对 照 组5.99±1.33 4.98±0.89 5.97±1.01 6.12±0.98模 型 组 12.59±2.68△△ 11.92±2.84△△ 12.57±3.51△△ 11.47±2.89△△芪 黄 明 目 低 剂 组 11.95±2.67 11.08±2.41 10.37±2.13 9.12±2.16芪 黄 明 目 中 剂 组 11.57±2.58 10.39±3.24 9.54±2.61* 8.56±1.97*芪 黄 明 目 高 剂 组 12.92±3.04 10.68±2.95 8.63±1.89＊＊ 7.81±1.78＊＊

2.2 氧化指标的变化

表2显示，模型组小鼠较对照组 SOD、GSH-Px、CAT活性均明显下降(P＜0.01)，MDA含量明显升高(P＜0.01)，与模型组比较，芪黄明目低剂组SOD活性上升(P＜0.01)，中剂组 SOD、GSH-Px活性上升(P＜0.01，P＜0.05)，MDA 含量降低(P＜0.05)，高剂组 SOD、GSH-Px、CAT活性均上升(P＜0.01，P＜0.05)，MDA 含量降低(P＜0.01)。

表2芪黄明目对DR小鼠血清SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA含量的影响(±s，n=10)

表2芪黄明目对DR小鼠血清SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA含量的影响(±s，n=10)

注:与模型组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与对照组比较:△△P＜0.01

组别 SOD(U·ml－1) GSH-Px(U·ml－1) CAT(U·g－1) MDA(nmol·ml－1)对 照 组 80.34±12.39 91.68±20.39 219.95±32.86 5.59±1.84模 型 组 44.61±10.56△△ 45.62±10.69△△ 117.28±25.64△△ 12.68±3.86△△GHMM 低 剂 组 60.25±11.27＊＊ 59.64±12.54 140.69±31.55 10.15±2.19 GHMM 中 剂 组 69.46±13.56＊＊ 65.59±21.14* 132.56±29.68 9.32±2.14*GHMM 高 剂 组 65.56±11.22＊＊ 73.25±19.79＊＊ 150.16±34.21* 8.35±2.63＊＊

2.3 形态学观察

图1显示，HE染色显示对照组视网膜各层细胞层次分明，细胞结构紧密;模型组视网膜色素上皮层明显变薄，细胞排列紊乱，芪黄明目能改善上述变化。电镜显示，对照组小鼠视网膜细胞排列整齐，细胞核和细胞器正常;模型组视网膜出现空泡变性，细胞内线粒体肿胀，基底膜增厚，芪黄明目治疗后细胞肿胀及基底膜增厚皆有明显减轻，高剂量组最为明显。

2.4 Western blot检测DR小鼠视网膜MAPK磷酸化

图1 小鼠视网膜超微结构的电镜观察结果(×5000)

表3图2显示，模型组p38MAPK蛋白磷酸化水平明显高于对照组，芪黄明目组p38MAPK蛋白磷酸化明显低于模型组(P＜0.01);模型组 JNK和ERK蛋白磷酸化水平明显高于对照组(P＜0.01)，芪黄明目组蛋白磷酸化与模型组比较无显著差异;p38MAPK、JNK、ERK蛋白在各组表达无统计意义。

表3芪黄明目对DR小鼠视网膜MAPK磷酸化的影响(±s，n=3)

表3芪黄明目对DR小鼠视网膜MAPK磷酸化的影响(±s，n=3)

注:与模型组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别p38MAPK p-p38MAPK JNK p-JNK ERK p-ERK对 照 组 0.74±0.18 0.29±0.07 0.58±0.14 0.34±0.06 0.3 0.52±0.07 0.82±0.19 0.39±0.11 0.59±0.14 7±0.12 0.24±0.06模 型 组 0.76±0.19 0.69±0.11＊＊ 0.53±0.13 0.86±0.19* 0.39±0.09 0.59±0.12*芪黄明目低剂组 0.72±0.14 0.59±0.09 0.57±0.09 0.87±0.13 0.35±0.08 0.61±0.15芪黄明目中剂组 0.81±0.22 0.42±0.07* 0.49±0.11 0.84±0.16 0.31±0.06 0.57±0.12芪黄明目高剂组 0.85±0.19 0.38±0.08*

图2 各组小鼠视网膜MAPK Western blot结果

3 讨论

芪黄明目胶囊是针对DR脉络瘀阻、络虚不荣、脉络绌急、热毒滞络等病理变化，采用化瘀通络为前提，配合滋润通补、补气通络、息风解痉、解毒通络诸法，从脉络论治DR的复方中药。芪黄明目胶囊由赤芍、黄芪、生地、决明子等药物组成，具有化瘀通络、益气养阴、止血明目之功效，用于治疗糖尿病视网膜病变，证属血瘀络阻、气阴两虚型，症见视物昏花、目睛干涩、面色晦暗、肢体麻木、倦怠乏力、气短懒言、五心烦热、口干咽燥、大便干结等。临床初步试验证实，芪黄明目胶囊治疗DR安全有效［2］。

高血糖是DM发生慢性并发症的根本原因，芪黄明目胶囊能降低自发性2型糖尿病KK/Upj-Ay小鼠的血糖，增加体重，明显缓解KK小鼠“三多一少”症状，并有剂量依赖性，表明芪黄明目有降低糖尿病小鼠血糖的作用。光镜和电镜结果显示，芪黄明目能改善视网膜病理损伤，从形态学上证实了芪黄明目对DR的确有保护作用，延缓糖尿病大鼠视网膜病变的发展，可能与降低血糖有关。

机体内氧化应激的产生主要源于自由基产生增多和(或)抗氧化防御功能损害。Brownlee博士［3］认为，糖尿病时高浓度的血糖水平抑制了线粒体电子转移链，当末尾环节受抑时氧化应激反应发生发展，导致超氧化物阴离子的过量产生。DU Y等［4］研究发现，体内、体外实验均可证明，高糖环境可以导致视网膜组织细胞中自由基产生增多。此外，高血糖时视网膜组织抗氧化系统功能下降也有大量报道［5］。本实验结果显示，模型组小鼠SOD、GSH-Px、CAT活性下降，MDA含量升高，与上述报道结果一致。给予芪黄明目治疗后，能明显提高小鼠 SOD、GSH-Px、CAT活性，降低 MDA含量，提示芪黄明目可抑制DR小鼠自由基产生，提高抗氧化功能，降低DR小鼠氧化应激反应。

最近，在细胞信号通路中起重要作用的蛋白激酶-丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)与DR的关系引起研究者高度关注。研究表明，糖尿病状态下的氧化应激可激活MAPK家族，通过一系列反应，参与DR的发生，影响 DR的进程，阻断 MAPK通路可抑制DR的发生［6］。MAPK分三大类，即细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun氨基端激酶(JNK)和p38MAPK［7］。我们运用 Western blot方法检测了DR小鼠视网膜 MAPK磷酸化的变化，发现p38MAPK、JNK、ERK磷酸化均被激活，给予芪黄明目干预，p38MAPK磷酸化水平降低，JNK、ERK磷酸化无明显变化，表明芪黄明目是通过抑制p38MAPK磷酸化水平而实现其抗氧化应激、保护DR视网膜的作用，其详细机制尚需进一步研究。

［1］薛嘉睿，郎平，吴昌凡.氧化应激在糖尿病视网膜病发病机制中的研究进展［J］.中国临床药理学与治疗学，2009，14(3):356-360.

［2］吴烈，晏飞，苏航，等.芪黄明目胶囊治疗非增殖期糖尿病视网膜病变的临床研究［J］.中国中医眼科杂志，2009，19(2):74-78.

［3］Brownlee M.The pathobiology of diabetic complications:a unifying mechanism ［J］.Diabetes，2005，54(6):1615-1625.

［4］Du Y， Miller CM， Kern TS. Hyperglycemia increases mitochondrial superoxide in retina and retinal cells［J］.Free Radic Biol Med，2003，35(11):1491-1499.

［5］Barot M，Gokulgandhi MR，Mitra AK.Mitochondrial dysfunction in retinal diseases［J］.Curr Eye Res，2011，36(12):1069-1077.

［6］Du Y，Tang J，Li G，et al.Effects of p38 MAPK inhibition on early stages of diabetic retinopathy and sensory nerve function［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2010，51(4):2158-2164.

［7］高怀林，王玲玲，贾振华，等.P38MAPK通路在内皮细胞F-actin蛋白表达中的作用及通络药物的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2010，16(9):769-771.